孟 莹，朱圣韬，李 鹏，张澍田

首都医科大学附属北京友谊医院消化科，国家消化系统疾病临床医学研究中心，北京市消化疾病中心，消化疾病癌前病变北京市重点实验室，北京100050

分泌型卷曲蛋白家族(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是Wnt 信号途径的调节剂，可通过竞争性抑制Frizzled 受体而抑制Wnt 的活动，参与多种肿瘤的发生。近年来，多个研究发现SFRP1 基因启动子区高甲基化导致的基因沉默可能与肿瘤的发生有关［1-3］。本研究目的是观察SFRP1 基因表达及启动子区甲基化在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表达情况，探讨DAC 及TSA 对SFRP1 基因表达的影响，从而进一步明确SFRP1 基因在ESCC 发病机制中的作用，为ESCC 的诊治提供新的可能的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1. 1 细胞:人类ESCC 细胞株EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 由中国医学科学院肿瘤研究所惠赠。Heec购自Sciencell(美国)，Het-1A 细胞购自ATCC(美国)。1.1.2 主要试剂和药品:5-氮杂脱氧胞苷(DAC)和曲古抑菌素(TSA)购自Sigma 公司;Anti-acetyl-Histone H3 和H4 购自Millipore 公司;染色质免疫共沉淀试剂盒购自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 细胞株经复苏后于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中培养并传代。Heec、Het-1A 复苏后于各自专用培养基中培养。

1.2.2 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测SFRP1 mRNA 表达:按TRIzol 试剂说明书提取各细胞系总RNA，并按照逆转录试剂盒说明将RNA 逆转录成cDNA。PCR 反应条件为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环，72℃延伸7 min。PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，GAPDH 作为内参照，其引物及退火温度见表1。

表1 引物序列表Tab 1 Sequences for primers used in this study

1.2.3 DNA 提取及亚硫酸盐修饰:使用细胞基因组DNA 提取试剂盒(TIANGEN DP208，中国)，按说明书进行。亚硫酸盐修饰采用CpGenome DNA 修饰试剂盒(Chemicon，CA，USA)，按说明书进行。修饰好的DNA 用于进一步的测序和MSP 分析。

1.2.4 甲基化分析:甲基化特异性PCR 方法(methylation-specific PCR，MSP)分析组织SFRP1 基因甲基化状态。引物序列见表1，引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR 反应条件95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸7 min。2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统观察PCR 产物条带的位置。

1.2.5 DAC 及TSA 处理EC9706 细胞:EC9706 细胞株保存于液氮中，临用前取出复苏，含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，按常规方法置于37℃、5% CO2混合气体恒温培养箱中进行培养。细胞每1 ～2 d 换液一次。每2 ～3 d 以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶4传代，接种在新培养瓶内。

单独给药时，将EC9706 细胞株分别与去甲基化制剂DAC 10 μmol/L 及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 共同孵育24 h 和72 h。DAC、TSA 联合应用时，则将DAC 10 μmol/L 与EC9706 细胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L与EC9706 细胞株共同孵育24 h。各浓度药物处理细胞后，每24 h 更换含药物的培养液一次。用倒置显微镜观察细胞生长情况及形态学变化，并且提取细胞总RNA 及用RT-PCR 方法检测SFRP1 mRNA 表达恢复情况。

1.2.6 染色质免疫共沉淀方法检测EC9706 细胞组蛋白乙酰化情况:采用ChIP 试剂盒进行检测，按说明书进行。计数大约3 ×106EC9706 细胞，甲醛交联组蛋白和DNA，超声破碎细胞和剪切DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定超声破碎效果。加入乙酰化组蛋白H3 抗体或乙酰化组蛋白H4 抗体沉淀，收集抗体绑定的组蛋白-DNA 复合物，逆转组蛋白-DNA 交联，用蛋白酶K 处理和纯化DNA，设计SFRP1 启动子区域的引物，引物序列见表1，PCR 方法鉴定已纯化的DNA，并用2%琼脂糖凝胶电泳，回收琼脂糖凝胶PCR 产物，连接T 载体，进行产物转化及蓝白斑筛选，鉴定阳性重组子和测序确认。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析。计数资料用s 描述，两组间变量比较采用t 检验。率的比较采用χ2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC 细胞系及永生化食管上皮细胞系中SFRP1 mRNA 的表达 EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13细胞株中均未见SFRP1 mRNA 表达，而Het-1A、Heec中可见其表达(见图1)。

2.2 ESCC 细胞株及永生化食管上皮细胞株中SFRP1 基因启动子区甲基化状态 MSP 方法检测ESCC细胞株及永生化食管上皮细胞株中SFRP1 基因启动子区甲基化状态(见图2)。EC109、EC9706、KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13均只见M 条带、U 条带未见;Het-1A、Heec U 条带亮，M 条带隐约可见;KYSE70 均可见U 和M 条带。

图1 ESCC 各细胞系及永生化食管上皮细胞系中SFRP1 基因的RT-PCR 电泳图Fig 1 Expression of the SFRP1 gene in ESCC cell lines，with GAPDH as a control

图2 MSP 方法示ESCC 各细胞株及永生化食管上皮细胞株中SFRP1 基因启动子区甲基化状态凝胶电泳图 U:非甲基化条带;M:甲基化条带Fig 2 Promoter hypermethylation of SFRP1 gene was shown in ESCC cell lines and two immortalized human esophageal epithelial cell lines (Het-1A and Heec) U:unmethylated;M:methylated

2.3 DAC 和TSA 干预对ESCC 细胞的影响 根据各株细胞SFRP1 表达水平及启动子区甲基化水平差异，选择高甲基化同时SFRP1 mRNA 无表达的EC9706 细胞株作为进一步研究对象。去甲基化制剂DAC 10 μmol/L 或组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 分别单独与EC9706 细胞株共同孵育72 h 和24 h 后，用RT-PCR 检测细胞株中SFRP1 mRNA 表达恢复情况，结果发现EC9706 细胞株SFRP1 mRNA 无明显变化(见图3A)。DAC 10 μmol/L 和TSA 联合应用，即DAC 10 μmol/L 与EC9706 细胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 与EC9706 细胞株共同孵育24 h，再次检测细胞株中SFRP1 mRNA 表达恢复情况，结果可见EC9706 细胞株SFRP1 mRNA 恢复表达(见图3B)。

2.4 EC9706 细胞株中SFRP1 基因启动子区组蛋白乙酰化状态 采用染色质免疫共沉淀技术分析EC9706 细胞株中SFRP1 基因启动子区域组蛋白乙酰化状态。分别用乙酰化组蛋白H3 抗体、乙酰化组蛋白H4 抗体沉淀DNA 作为模板进行PCR，兔IgG 作为阴性对照，每次实验均带有内对照(Input)。PCR 鉴定结果进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4 所示。PCR 产物回收后进行连接测序，结果符合SFRP1 基因启动子区序列。

图3 DAC 和TSA 干预对EC9706 细胞株中SFRP1 mRNA表达影响的RT-PCR A:DAC 和TSA 单独干预EC9706 细胞株中后，未见EC9706 细胞株SFRP1 mRNA 表达恢复;GAPDH:内参照;B:DAC 10 μmol/L 与TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 联合干预后，可见EC9706 细胞株SFRP1 mRNA 表达恢复Fig 3 Re-expression of SFRP1 mRNA in EC9706 after treatment with DAC and/or TSA by RT-PCR A:EC9706 cells were treated with DAC and TSA alone，with GAPDH as a control;B:EC9706 cells were treated with DAC and TSA together

图4 EC9706 细胞株中SFRP1 基因启动子区域组蛋白H3、H4 乙酰化状态ChIP 结果 H3Ac、H4Ac:实验对象;NAC:阴性对照;IN:内对照Fig 4 Histone modification analysis at CpG islands of the SFRP1 promoter region by ChIP assay H3Ac，H4Ac:experimental object;NAC:negative control;IN:internal control

3 讨论

SFRP1 基因位于染色体8p12-11.1，该位点在多种肿瘤中缺失，被认为可能是一个抑癌基因［4-5］。抑癌基因表达沉默是肿瘤发生过程中一个重要的发病机制，而DNA 甲基化是抑癌基因表达沉默的重要途径。Suzuki 等［2-3］研究认为启动子区高甲基化所介导的转录沉默是结直肠癌SFRP1 水平降低的主要机制;乳腺癌中也可见类似的研究结果。

本研究中我们发现SFRP1 基因作为一个可能的抑癌基因，在ESCC 细胞株中完全不表达，而在永生化食管上皮细胞中可以检测到该基因的明显表达，表明该基因存在转录水平表达改变，提示SFRP1 基因可能作为一个抑癌基因，在ESCC 发病机制中发挥一定作用。同时，MSP 研究发现，ESCC 肿瘤细胞系中存在SFRP1 基因启动子区高甲基化，而在永生化人类食管上皮细胞系中甲基化程度极低。提示启动子区甲基化可能与ESCC 中SFRP1 基因的表达异常相关。Ishii等［6］研究发现SFRP1 在ESCC、上皮内瘤变及正常组织中均存在启动子区高甲基化，甲基化程度呈逐渐降低趋势，这和我们的研究结果相一致。

研究表明DNA 高甲基化可被许多因素调控，去甲基化制剂是最常见的一种干预手段，可使部分表达沉默的抑癌基因表达恢复。5 氮杂脱氧胞苷是有效的甲基转移酶抑制剂，能时间和剂量依赖性地引起CpG 岛过甲基化的抑癌基因去甲基化，从而恢复其mRNA 和蛋白质的表达，在基因表达调控、DNA 修复、基因稳定等方面起重要作用［7］。TSA 是一种常用的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂，能够抑制HDAC 活性，使组蛋白高度乙酰化，以此来调节基因表达。近年来，研究发现CpG 岛甲基化和组蛋白修饰既可独立存在，也能相互影响［8］。有研究认为，DNA 甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂联合应用对恢复抑癌基因表达的作用可高于单独应用某一种［9-10］。

我们选择SFRP1 基因mRNA 不表达且同时存在基因启动子区高甲基化的EC9706 细胞株作为进一步研究对象，单独给予DAC 及TSA 处理，均未能恢复SFRP1 基因的表达;但联合DAC 和TSA 共同处理该细胞株后，SFRP1 基因表达却得到了恢复，表明基因启动子区甲基化和组蛋白乙酰化修饰可能共同参与了SFRP1 基因的转录调控。国内外其他研究也发现联合应用DAC 及TSA 可有效恢复Wnt 相关基因mRNA 再表达［11-12］。

为进一步说明组蛋白乙酰化和DNA 甲基化共同参与了SFRP1 在EC9706 细胞中的转录表达的调控过程，我们还用ChIP 方法以乙酰化组蛋白H3、H4 抗体免疫沉淀染色质片段，然后PCR 扩增SFRP1 基因启动子区，扩增出SFRP1 基因启动子区片段后进行克隆测序，测序结果证实为SFRP1 基因启动子区序列，从而表明SFRP1 基因启动子区结合有乙酰化组蛋白H3 及H4，进一步说明组蛋白乙酰化和DNA 甲基化共同参与了SFRP1 在EC9706 细胞中的转录表达的调控过程。

综上所述，本研究结果证实，ESCC 中存在SFRP1基因的表达下调和SFRP1 基因启动子区高甲基化及组蛋白乙酰化，去甲基化制剂DAC 和HDAC 抑制剂共同作用可恢复SFRP1 基因转录表达。从实验中我们可以进一步推测，SFRP1 基因作为一个可能的抑癌基因，其异常表达和启动子区高甲基化可能通过Wnt 通路参与了ESCC 的发病过程，未来可能为ESCC 患者的诊治提供新的方向，但仍需要进一步的实验及临床研究来证实。

［1］ Valcz G，Patai AV，Kalmár A，et al. Myofibroblast-derived SFRP1 as potential inhibitor of colorectal carcinoma field effect［J］. PLoS One，2014，9 (11):e106143.

［2］ Suzuki H，Gabrielson E，Chen W，et al. A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer［J］. Nat Genet，2002，31(2):141-149.

［3］ Wang S，Dorsey TH，Terunuma A，et al. Relationship between tumor DNA methylation status and patient characteristics in African-American and European-American women with breast cancer［J］. PLoS One，2012，7(5):e37928.

［4］ Armes JE，Hammet F，de Silva M，et al. Candidate tumor-suppressor genes on chromosome arm 8p in early-onset and high-grade breast cancers［J］. Oncogene，2004，23(33):5697-5702.

［5］ Awakura Y，Nakamura E，Ito N，et al. Methylation-associated silencing of SFRP1 in renal cell carcinoma［J］. Oncol Rep，2008，20(5):1257-1263.

［6］ Ishii T，Murakami J，Notohara K，et al. Oesophageal squamous cell carcinoma may develop within a background of accumulating DNA methylation in normal and dysplastic mucosa［J］. Gut，2007，56(1):13-19.

［7］ Fulda S，Kufer MU，Meyer E，et al. Sensitization for death receptoror drug-induced apoptosis by re-expression of caspase-8 through demethylation or gene transfer ［J］. Oncogene，2001，20 (41):5865-5877.

［8］ Sarkar S，Horn G，Moulton K，et al. Cancer development，progression，and therapy:an epigenetic overview［J］. Int J Mol Sci，2013，14(10):21087-21113.

［9］ Steele N，Finn P，Brown R，et al. Combined inhibition of DNA methylation and histone acetylation enhances gene re-expression and drug sensitivity in vivo［J］. Br J Cancer，2009，100(5):758-763.

［10］ Cameron EE，Bachman KE，Myohanen S，et al. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer［J］. Nat Genet，1999，21(1):103-107.

［11］ Gotze S，Wolter M，Reifenberger G，et al. Frequent promoter hypermethylation of Wnt pathway inhibitor genes in malignant astrocytic gliomas［J］. Int J Cancer，2010，126(11):2584-2593.

［12］ Qi J，Zhu YQ，Luo J，et al. The role of secreted Wnt-antagonist genes hypermethylation in early detection of colorectal tumor ［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2007，87(28):1954-1957.