盐碱胁迫对紫花苜蓿根系Na+、K+离子流速的影响

郭鹏，张万筠，鲍雅静

(大连民族大学 环境与资源学院， 辽宁 大连 116605)

摘要：中国盐碱地形成，大部分与土壤中碳酸盐的累计有关，因而碱化度普遍较高。在盐碱地再利用过程中，简单说，可以分为轻盐碱地、中度盐碱地和重盐碱地。利用NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34种盐，按不同比例配比，人工模拟盐碱地中轻盐碱地盐碱度、中度盐碱地盐碱度和重盐碱地盐碱度。选用耐盐苜蓿品种金皇后、中度耐盐苜蓿品种阿尔冈金、敏感苜蓿品种敖汉，分别进行盐碱胁迫实验；通过非损伤微测技术检测苜蓿根系Na+ 、K+离子流变化，比较轻盐碱度、中度盐碱度和重盐碱度胁迫下3个耐盐苜蓿品种的离子流速差异。结果显示：在盐碱胁迫下，耐盐碱品种金皇后Na+离子流速外流速度比中度耐盐品种阿尔冈金要高，且均表现为外流；敏感品种敖汉在中度盐碱环境下由外流转变为内流，并出现萎蔫迹象。3个苜蓿品种的K+离子流速都发生变化，表现为外流，但流速变化各不相同且无明显的规律性。所以，在盐碱抗逆性中紫花苜蓿可以通过Na+离子流速控制来适应盐碱环境。

关键词：盐碱地；紫花苜蓿；盐碱胁迫；非损伤微测技术；离子流速

收稿日期：2015-06-25；最后修回日期：2015-07-01

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31170168)；国家星火计划资助项目(2012GH531899，2013GA651006)；辽宁省科技计划项目(2011209001)；辽宁省高等学校优秀科技人才项目(LR2013055)。

作者简介：郭鹏(1980-)，男，山东青岛人，讲师，博士，主要从事植物抗逆学研究。

文章编号：1009-315X(2015)05-0439-06

中图分类号：S541.9文献标志码：A

Influence of Salt Stress on the Ion Flow Velocity of the Na+and K+ion in Alfalfa Root

GUO Peng, ZHANG Wan-jun, BAO Ya-jing

(College of Enviroment and Resources, Dalian Nationlities University,Dalian Liaoning 116605, China )

Abstract:The formation of saline is relation to carbonate’s cumulative, so the degree of alkalisation is generally higher in the saline. Simply put, the saline can be divided into light , moderate and heavy saline salinity in the use process. In this study, we use NaCl, Na2SO4, NaHCO3, Na2CO3 to artificially simulate the light, moderate and heavy saline according to the different proportions. Meanwhile, we select the salt-tolerant alfalfa variety: God Empress, moderately tolerant alfalfa variety: Algonquin, sensitive alfalfa variety: Aohan to conduct saline stress experiments. Ion flow variation is detected by using Non-invasive Micro-test Technique for the Na +, K + ion in the alfalfa roots, and the Na +, K + ionic velocity differentia of God Empress, Algonquin, Aohanare under light salinity, moderate salinity and heavysalinity stress is compared. The results show that: under salinity stress, God Empress Na + ion velocity rate is faster than Algonquin, and they show outflows; Aohan under the moderate saline environment varies from outflow to internal flow, and shows signs of wilting. The three varieties alfalfa of K+ ion velocity all chang, but the variation of the ion velocity are not the same and without obvious regularity, and display outflow. Therefore, in the saline alkali tolerance, Alfalfa may adapt to the saline environment by controlling Na+ ion velocity.

Key words:saline; alfalfa; salinity stress; Non-invasive Micro-test Technique; ion flow velocity

干旱、盐碱等非生物逆境胁迫时常严重影响植物的正常生长发育, 也是导致农作物减产的重要环境因素[1]。植物在长期的进化过程中, 在分子、细胞和生理生化水平上均已形成应对外界不良环境的一系列应答机制[2]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv)是世界上分布最广泛的豆科牧草，也是中国种植面积最大的饲草饲料作物，在发展畜牧业生产、改良土壤和保护生态环境等方面发挥着重要的经济、生态和社会效益[3]。目前土壤盐碱化已成为制约中国农业发展的重要问题，并影响到生态系统的稳定和生物的多样性[4-6]。紫花苜蓿作为一种非常重要的豆科牧草，培育抗盐、抗碱的苜蓿新品种具有重要的现实迫切性。

本实验利用NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO34种盐,按不同比例配比,人工模拟盐碱地中轻盐碱地盐碱度、中度盐碱地盐碱度和重盐碱地盐碱度，选用耐盐苜蓿品种金皇后、中度耐盐苜蓿品种阿尔冈金、敏感苜蓿品种敖汉分别进行盐碱胁迫实验；通过非损伤微测技术检测苜蓿根系Na+、K+离子流速变化，比较轻盐碱度、中度盐碱度和重盐碱度胁迫下耐盐苜蓿品种的差异，该研究可为紫花苜蓿耐盐碱育种研究提供新的理论支持。

1材料与方法

1.1　材料

耐盐型紫花苜蓿品种：金皇后(God Empress)；中度耐盐型紫花苜蓿品种：阿尔冈金(Algonquin)；盐敏感型紫花苜蓿品种：敖汉(Aohan)。

1.2　材料培养

1.2.1苜蓿种子萌发

种子用3 %的次氯酸钠溶液消毒15 min，75 %的酒精清洗2~3次。蒸馏水浸种20~24 h后，挑选萌发一致的种子置于培养皿中，培养皿中铺垫单层滤纸，用蒸馏水浸湿滤纸，每天置换滤纸，培养3~5 d后移植。

1.2.2盐碱混合胁迫处理

盐碱地利用的简单分类：轻度盐碱地pH值为7.1~8.5，中度盐碱地pH值为8.5~9.5，重度盐碱地pH值为9.5以上。实验中用A1组、A2组、A3组分别表示轻度盐碱地(A1组:V(NaCl):V(Na2SO4):V(NaHCO3):V(Na2CO3)=1:2:1:0,pH值7.77±0.104)、中度盐碱地(A2组:V(NaCl):V(Na2SO4):V(NaHCO3):V(Na2CO3)=1:9:9:1,pH值8.80±0.043)、重度盐碱地(A3组: V(NaCl):V(Na2SO4):V(NaHCO3):V(Na2CO3)=1:1:1:1,pH值9.84±0.013)。人工模拟盐碱地盐碱浓度混合比见表1。

表1　人工模拟盐碱地盐碱浓度混合物质的量　mol

将萌发一致的紫花苜蓿幼苗移栽花盆，每盆5苗，3次重复， 先用蒸馏水浇灌，一次浇透，每隔2 d浇一次。缓苗30 d后，用不同盐碱混合溶液进行混合胁迫，每盆80 mL盐碱混合液,分4次浇灌，每次间隔2 d。每隔24 h用PHS-3C型数字pH计测定流出液的电导率、pH值，连续测定至pH值基本不变为止(盆下流出液体的pH值、盐分浓度与实验设计的要一致)。对照组不处理。处理共计10 d。盐碱胁迫浓度设置空白组A0(正常盐碱度)、A1组(轻度盐碱度)、A2组(中度盐碱度)、A3组(重度盐碱度)。

1.3　方法

1.3.1Na+离子流速检测

Na+离子流速检测利用非损伤微测系统(YoungerUSA (Xuyue Beijing) NMT Service Center)完成。以非损伤性扫描离子选择电极技术获取进出紫花苜蓿根系的Na+离子浓度( mmol·L-1级)、流速及流向信息。离子选择性电极由玻璃微电极、Ag/AgCl导线、电解质及液态离子交换剂( LIX) 组成。该电极在待测离子浓度梯度中以已知距dx进行两点测量， 可测得两点的电压分别为V1、V2,再通过已知的该电极的电压/浓度校正曲线计算离子的浓度。通过物理学中的离子/分子扩散定律的数学公式：J0=-D *dc/dx，可获得该离子的流动速率(pmol·cm-2·s-1)。式中，D 为离子/分子特异的扩散常数(cm-2·s-1)。本实验所用微电极均为旭月公司提供。Na+选择性微电极前端灌充250 Lm Na+离子的液态交换剂液柱，后端灌充有15～50 mm 左右的电解液柱( 100 mmol·L-1NaCl)，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。固体电极作为参比电极。玻璃微电极需要校正后使用， 校正斜率在58±3范围内为合格电极，可用于检测。校正液中Na+的浓度分别设置为0.1和1 mmol·L-1，其他成分与测试液相同。

幼苗在测量前10 min转移到装有测试液(0.1mmol CaCl2，0.1mmol KCl，0.5 mmol NaCl，0.2 mmol Na2SO4，0.3 mmol MES，pH值5.8)的测试盒中平衡。测试时，将幼苗根系置于测试液中，用小玻璃块将测试部位固定压好。测量区域是位于距离根尖300~400 um的根系根毛区。将电极尖端置于距离根表10 Lm处作为原点，在垂直于根表面的方向进行两点移动，测量两点电压差，两点移动距离为30 Lm(如图1)。每个样品稳定测量10 min。

图1　非损伤性扫描离子选择电极测试图 ① 微电极；②根尖端距离；③ 电极移动方向。

所测结果利用校正得到的Nernst slope将测量两点之间电压差换算成离子浓度差。再将结果代入Fickcs第一扩散定律，就可获得该离子的流动速率(pmol·cm-2·s-1)。在试验中，流速计算利用Mage flux 软件(YoungerUSA Sc.i & Tech. Corp.,USA)完成。在净离子流的计算过程中，基本上认为根表面离子流运动符合圆柱扩散几何模型。

1.3.2K+离子流速检测

K+离子流速的测定方法与Na+离子流速的测定方法相同。

2结果与分析

2.1　盐碱胁迫对紫花苜蓿根系Na +吸收的影响

盐碱胁迫后紫花苜蓿根系Na+平均流速及流向如图2。与对照组(A0)相比，在盐碱混合胁迫下盐敏感品种敖汉Na+离子流速成下降趋势，在轻度盐碱度表现为外流，在中度盐碱度和重度盐碱度转变为内流；中度耐盐品种阿尔冈金由对照组的内流转换为外流，在轻度盐碱度和中度盐碱度离子流速有上涨的趋势，在重度盐碱度时离子流速回落；耐盐品种金皇后也是由内流转换为外流，但是流速变化幅度较大，在中度盐碱度时可达到818 pmol· cm-2·s-1，而在重度盐碱度时流速急剧下降，但是外流速度还是高于阿尔冈金。从总体上分析，敖汉在盐碱胁迫下Na+离子流速呈现下降趋势，在中度盐碱度胁迫时离子由外流转变为内流，阿尔冈金与金皇后离子流速呈现上升的趋势，但是在重度盐碱度时Na+离子流速有所回落。以上结果显示，耐盐性强的紫花苜蓿在盐碱胁迫下Na+离子流速显著大于敏感品种，这说明，在盐碱环境下耐盐性强的紫花苜蓿品种可以通过提高Na+的外流速度来适应盐碱环境。

图2　盐碱胁迫后紫花苜蓿根系Na +平均流速及流向

比较相同浓度下盐碱胁迫3个品种Na+离子流速。在正常浓度下敖汉Na+离子流速表现为外流，最高离子流速可达875 pmol· cm-2·s-1，阿尔冈金和金皇后表现为内流流速大约在256 pmol· cm-2·s-1和132 pmol· cm-2·s-1，如图3(a)；在轻度盐碱度中3个品种基本表现为外流，金皇后外流速度最快，最高流速为1 400 pmol·cm-2·s-1，敖汉和阿尔冈金相对较低，如图3(b)；在中度盐碱度下，3个品种流速变化都比较明显，Na+外流速度都有所增加，但是阿尔冈金变化幅度最小，如图3(c)；在重度盐碱度下，敖汉Na+开始内流，阿尔冈金外流速度也大幅度下降，但还是表现为外流，而金皇后外流速度也有所减小，幅度变化不大，只有30 pmol·cm-2·s-1左右，如图3(d)。以上结果显示，在不同盐碱环境下不同品种的紫花苜蓿在排钠速度的稳定性不同，金皇后在各个盐碱环境下的Na+离子流速最为稳定(重度盐碱度除外，pH值和碳酸根浓度过高影响紫花苜蓿正常生长)。

(a)

(b)

(c)

(d)

2.2　盐碱胁迫对紫花苜蓿根系K +吸收的影响

在盐碱胁迫下3个紫花苜蓿品种的K+离子平均流速都表现为外流，平均流速变化各不相同，与对照组(A0)相比，敖汉在轻度盐碱下K+平均流速有所增加外，在中度盐碱环境和重度盐碱环境中基本保持不变；阿尔冈金在对照组中表现为K+平均流速高速外流，在盐碱胁迫下K+平均流速都有所变化，轻度盐碱环境下K+平均流速急剧下降，中度盐碱环境下K+平均流速回升，在重度盐碱环境下又急剧下降，但还是高于轻度盐碱环境的K+平均流速；金皇后的K+平均流速变化趋势与阿尔冈金类似，只是在轻度盐碱环境下K+平均流速下降更为急剧(如图4)。结果显示，3个品种在盐碱胁迫下K+离子平均流速都表现为外流，平均离子流速变化各不相同，中度耐盐品种阿尔冈金和耐盐品种金皇后的变化趋势类似。

图4　盐碱胁迫后紫花苜蓿根系K +平均流速及流向

比较相同浓度下盐碱胁迫3个品种K+离子流速。在3种盐碱环境K+离子流速均表现为外流，除在轻度盐碱环境外金皇后离子流速都比其他两个品种流速要高，最高流速可达325 pmol·cm-2·s-1(如图5)。在3个不同盐碱环境下，敖汉、阿尔冈金和金皇后的K+离子流速变化各不相同，在轻度盐碱环境中敖汉K+离子流速增加，在中度盐碱环境下又回复平稳，与对照组基本一致，而在重度盐碱下K+离子流速波动幅度明显变大；阿尔冈金和金皇后的K+离子流速虽然各有变化，但变化幅度比较平稳，没有较大的波动。

(a)

(b)

(c)

(d)

2.3　盐碱胁迫对紫花苜蓿根系Na +、K +离子流速综合分析

Na+、K+合并后的离子流速图如图6。可以观察到，盐碱胁迫下紫花苜蓿K+离子流速都表现为外流作用，Na+离子流速变化较大。在对照组中，除敖汉Na+离子流速为外流外其他都表现为内流，盐碱胁迫后Na+流速迅速变化，由内流转变为外流，而K+离子流速迅速增加。敖汉在轻度盐碱胁迫下Na+离子流速急剧减小为6.95 pmol·cm-2·s-1，K+离子流速却随之增加；在中度盐碱和重度盐碱胁迫下Na+、K+离子流速都有回落，甚至出现Na+内流的情况，此时与敖汉在此浓度胁迫下活力降低，出现萎蔫的情况一致。阿尔冈金在盐碱胁迫下Na+由内流转变为外流，离子流速随着盐碱度增加略有上涨的趋势，而K+外流速度先下降有回升的趋势。与阿尔冈金类似，金皇后K+外流速度也出现回落或回升的趋势，而Na+离子流速变化明显特别是在轻度盐碱度和重度盐碱度中，最高流速可达818.03 pmol· cm-2·s-1。从Na+、K+叠加图可以看出，在盐碱胁迫下紫花苜蓿可以通过拒Na+方式适应盐碱环境。

图6　盐碱胁迫后紫花苜蓿Na +/K +合并离子流速及流向

图6数据显示，紫花苜蓿在盐碱胁迫下对K+离子流速变化有一定的影响作用，但K+离子流速变化规律无迹可寻或不成规律，对于紫花苜蓿耐盐碱性强弱是否与K+离子流速有关还需进一步研究。

3讨论

通常在盐碱胁迫下，植物生长缓慢，代谢受到抑制，严重时出现盐斑，叶子萎蔫，甚至死亡。现有研究表明，与大多数甜土植物一样，紫花苜蓿属于拒Na+植物，而且其拒Na+能力与耐盐性密切相关[7-11]。盐胁迫下，虽然各紫花苜蓿品种地上部Na+含量都有所上升，但与耐盐品种相比，盐敏感型品种地上部Na+含量更高[12-14]。地上部较高的Na+/ K+是造成紫花苜蓿盐害的主要原因[15-18]。Bao等[19]研究表明，地上部Na+/ K+与品种的耐盐性呈负相关关系。因此，在盐胁迫下维持较低的Na+/ K+有助于减轻盐分对紫花苜蓿植株，特别是其地上部的伤害，从而维持其正常生长。王小山等[20]研究表明，中性盐和碱性盐胁迫后，苜蓿根、茎、叶的Na+含量升高，碱性盐处理的根、茎 Na+含量显著高于中性盐处理，中性盐和碱性盐胁迫后，碱性盐胁迫下的 Na+/ K+值高于中性盐胁迫；碱性盐胁迫使Na+/Mg+比值高于中性盐胁迫，碱性盐胁迫抑制根对Al+的吸收，但对其向茎和叶中运输则影响不大。混合碱性盐胁迫弱化了苜蓿对Na+吸收与运输的控制，增强了Na+的毒害，中性、碱性混合盐胁迫条件下，重要养分离子在苜蓿植株根、茎、叶中的含量存在差异，进一步说明紫花苜蓿对中性和碱性盐胁迫的适应机制不同，这可能与溶液高 pH值和高浓度的碳酸根存在有关。

4结论

(1)在轻度、中度、重度盐碱浓度胁迫下，敏感型紫花苜蓿品种敖汉Na+离子流速逐渐下降，在中度盐碱环境下由外流转变为内流；中度耐盐紫花苜蓿品种阿尔冈金Na+离子流速呈上升趋势，由对照组的内流转变为外流，且外流速度在轻度、中度盐碱环境下逐渐上升，在重度盐碱环境下有回落。

(2)耐盐紫花苜蓿品种金皇后的Na+离子流速与中度耐盐品种阿尔冈金类似，在轻度和中度盐碱环境下Na+离子流速逐渐上升，在重度盐碱环境下回落，导致回落的原因可能是胁迫溶液的pH值过高和高浓度的碳酸根存在有关。从总体上分析，在盐碱胁迫下，敏感型品种敖汉Na+离子流速逐渐下降；中度耐盐品种阿尔冈金Na+离子流速逐渐升高；耐盐品种金皇后Na+离子流速逐渐升高，但增幅比中度耐盐品种阿尔冈金要大。所以，紫花苜蓿在一定pH值和碳酸根浓度的盐碱环境下，可通过控制Na+离子流速维持正常的生长。

(3)在不同盐碱浓度的胁迫下，3种紫花苜蓿品种的K+离子流速始终表现为外流，且流速均发生变化。由于盐碱胁迫浓度梯度设置，无法体现K+离子流速变化是否与盐碱度相关，关于紫花苜蓿在盐碱胁迫下K+离子流速与耐盐碱性的相关性还需做进一步研究。

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(责任编辑邹永红)