营养组合物对再生障碍性贫血小鼠肝干细胞的影响

苗小艳贾莉杨佩满1

(大连医科大学检验医学院，辽宁大连116044)

摘要〔〕目的探讨营养组合物治疗再生障碍性贫血(AA)的作用机制。方法BALB/c 小鼠100只随机分组，分别给予相应处理，通过肝组织切片苏木素-伊红染色(HE染色)观察肝细胞；紫外分光光度计检测小鼠肝细胞线粒体DNA含量；流式细胞仪检测肝干细胞(CD90+)。结果肝干细胞与正常对照组相比，AA模型组小鼠肝干细胞数量明显减少，营养组合物处理AA小鼠后，小鼠肝干细胞的含量随营养组合物剂量增加而增加，尤以高、中营养组合物组明显(P<0.05)，表明营养组合物促进AA小鼠肝干细胞的增殖。结论营养组合物能够明显改善AA小鼠肝干细胞数量和结构，此可能为其治疗AA的作用机制之一。

关键词〔〕再生障碍性贫血；骨髓干细胞；肝干细胞；营养组合物；乙酰苯肼；环磷酰胺；CD90+；线粒体

中图分类号〔〕R3〔文献标识码〕A〔

通讯作者：贾莉(1968-),女,教授,博士，博士生导师，主要从事细胞生物学研究。

1大连医科大学组织胚胎学教研室

第一作者：苗小艳(1966-),女,实验师,主要从事细胞生物学研究。

关于骨髓干细胞中的肝细胞，目前认为有可能是定向干细胞，在肝脏损伤的情况下直接分化形成肝细胞；也有可能是多能干细胞或残留的胚胎样原始细胞，在特定条件下通过分化或融合的方式产生肝细胞；还有可能是其他类型的干细胞，在肝脏损伤条件下通过横向分化的途径产生肝细胞〔1〕。CD90+是一种细胞表面糖蛋白，是肝干细胞的标志物，同时也是血液干细胞的抗原决定簇。本研究观察自制营养组合物对再生障碍性贫血(AA)小鼠肝干细胞的影响，旨在为营养组合物的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料营养组合物(大连珍奥集团提供，由核苷酸、精氨酸、甘氨酸、卵磷脂、脑磷脂、维生素C、维生素B12、维生素E、铁、叶酸、硒、葡萄籽提取物等组成，按原方比率配方，经水煎、超声、浓缩，配制成口服液，分装备用)；乙酰苯肼；环磷酰胺(上海华联制药有限公司)；兔抗小鼠CD90抗体；羊抗兔IgG；卫永超薄切片机；Epson微机；Summa Sketch PIus 数字化仪；Sigmascan软件；流式细胞仪(FACS Calibur，美国Becton Dickinson公司)；紫外分光光度计。

1.2实验动物及试验流程BALB/c小鼠100只，雌雄各半，8～12周龄，18～22 g。由大连医科大学实验动物中心提供。小鼠AA模型建立：第1天给予小鼠皮下注射乙酰苯肼100 mg/kg，次日X射线2.0 Gy(美国瓦里安2300C/D，6 MV，X射线，照射距离25 cm，剂量率300 cGy/min)照射后，于第5天环磷酰胺80 mg/kg腹腔注射，第15天重复以上步骤但不给予射线处理。以铅砖屏蔽施以假照射及单纯等量生理盐水相应部位注射为正常对照组。根据动物药理学的药品剂量和综合实验的设计分析，分为：①正常对照组；②AA模型组；③营养组合物高剂量组，以1 445.55 mg·kg-1·d-1对小鼠灌胃；④营养组合物中剂量组，以963.7 mg·kg-1·d-1对小鼠灌胃；⑤营养组合物低剂量组，以674.59 mg·kg-1·d-1对小鼠灌胃，每组20只。实验流程：按前述AA小鼠模型的建立方法，注射乙酰苯肼、环磷酰胺及X射线照射。从第7天开始，营养组合物高、中、低剂量组分别以相应剂量对小鼠进行灌胃，每天一次，直至第45天，颈椎脱臼处死小鼠，进行下列检测。

1.3实验方法

1.3.1流式细胞仪分析将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，离心(1 000 r/min，5 min)收集细胞，用PBS重悬为1×106/ml的细胞悬液，分别取200 μl转移至Eppendorf管中，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，沉淀加入5%脱脂奶粉37℃封闭0.5 h。PBS洗涤一次，加入1∶200兔抗小鼠 CD90-多克隆抗体， 37℃孵育2 h。然后PBS洗涤一次，除去未结合的一抗。加入标记荧光素的羊抗兔IgG，工作浓度1∶1 000，37℃避光孵育0.5 h，PBS洗涤二次 (1 000 r/min，5 min)，用流式细胞仪检测表达CD90+细胞数量变化，以标记抗体呈阳性的细胞百分率作为表达CD90蛋白(肝干细胞标志物)的计量标准。同时以只加标记荧光素的羊抗兔IgG和不加一抗、二抗的细胞作阴性对照。

1.3.2苏木素-伊红染色(HE染色)切片置于玻片架上，自来水冲洗，苏木素染色10～15 min，自来水流水冲洗。然后置盐酸酒精中2～3 min，热水冲洗4～5 min， 至蓝色反蓝。伊红染色1 min，自来水流水洗涤，分别经75%，85%，95%，100%酒精脱水。最后经自来水洗涤、吹干、封片、镜检。

1.3.3线粒体DNA含量测定将骨髓单个核细胞(5×107)、新鲜组织肝脏匀浆、裂解、离心，获取线粒体。按照DNA提取试剂盒说明提取线粒体中的DNA，采用紫外分光光度计测量其含量。计算公式如下：DNA浓度(μg/μl)= A260×50 μg/ml ×稀释倍数×10-1。

1.4统计学分析采用SPSS12.0软件进行t检验。

2结果

2.1营养组合物对AA小鼠肝脏的影响肝病理切片HE染色显示，与正常对照组相比，AA模型组小鼠肝脏组织水肿明显，小叶结构欠清晰，大部分肝细胞胞质疏松、淡染，胞质内出现大小不等空泡，细胞核固缩，染色质深染，肝血窦及中央静脉扩张，充血。不同剂量的营养组合物组与AA模型组比较，肝脏组织水肿减少，小叶结构明显清晰，肝细胞形态正常，但低剂量组恢复的稍差一些，表明营养组合物对AA性贫血小鼠肝脏有显著恢复作用。见图1。

图1　营养组合物对AA小鼠肝的影响(HE，×1 000)

2.2紫外分光光度计检测肝细胞线粒体DNA含量与正常对照组相比，AA模型组小鼠肝细胞线粒体DNA的含量明显下降〔(1.03±0.06)μg/ml vs (1.86±0.19)μg/ml,P<0.05〕；高、中、低剂量的营养组合物组〔(1.52±0.12) μg/ml、(1.24±0.1)μg/ml、(1.19±0.9)μg/ml〕与AA模型组比较，小鼠肝细胞线粒体DNA的含量明显增高，呈量效关系(P<0.05)。

2.3流式细胞仪检测肝干细胞(CD90+)与正常对照组相比，AA模型组小鼠肝干细胞数量明显减少(2.26%±0.18% vs 11.67%±1.23%,P<0.05)，营养组合物处理AA小鼠后，小鼠肝干细胞CD90+的含量随营养组合物剂量增加而增加(高、中、低剂量组分别为9.44%±0.84%、5.12%±0.43%、2.86%±0.25%,P<0.05)，表明营养组合物促进AA小鼠肝干细胞增殖。

3讨论

近年来有证据证明人的骨髓造血干细胞也可转化为肝干细胞，说明骨髓细胞和肝细胞间存在密切关系〔2〕。Petersen等〔3〕在实验研究中也证实了人类骨髓细胞向肝细胞转化的可能性。CD90+是一种细胞表面糖蛋白，是肝干细胞的标志物，同时也是血液干细胞的抗原决定簇。近几年确定了几种特定表达在干细胞和早期祖细胞的抗原，如CD90+(Thy-1)，KDR，CD133受体，其中CD90+被认为是造血干细胞的又一标志性抗原，在造血干祖细胞分化发育过程中CD90+先于CD34+分子出现，在早期造血干细胞中表达〔4〕，这可能对造血干祖细胞的研究提供新的途径和新的方法。促进造血干细胞增殖与血红蛋白合成营养组合物是将核苷酸等多种营养成分进行合理搭配，相互配合，其中甘氨酸为血红素的基本原料，参与合成甘氨酰胺合成酶参加嘌呤核苷酸合成，利于造血干细胞增殖。脑磷脂、卵磷脂为线粒体及造血干细胞组分；核苷酸类营养物不仅有助于基因的复制、损伤基因的自主修复、基因表达，也有助于线粒体的增殖〔5〕。各种营养成分协同提高AA小鼠刺激骨髓造血干细胞的增殖，使造血干细胞和肝干细胞明显增多，对骨髓的造血功能有明显的促进作用；同时可明显提高骨髓造血细胞和肝细胞内线粒体数目，对改善AA小鼠骨髓抑制状态有显著作用〔6〕。本实验显示营养组合物可使AA小鼠细胞线粒体病理变化改善，有效提高干细胞增殖与线粒体的数目，对骨髓造血微环境有明显的保护和修复作用；能抑制跨膜电位下降及细胞凋亡，促进AA小鼠肝干细胞的增殖，可能机制为营养组合物能促进骨髓造血干细胞向肝干细胞发育、增殖、分化，并且改善骨髓造血微环境或骨髓重建。

4参考文献

1郑桃.肝干细胞的研究进展〔J〕.四川医学，2011;33(10)：1660-2.

2洪国庆.肝干细胞在肝脏疾病中应用的研究进展〔J〕.检验医学与临床，2012;9(13)：1622-3.

3Petersen BE，Bowen WC，Patrene KD，etal.Bone marrow as a potential source of hepatic oval cell〔J〕.Science，1999;284(5417)：1168-70.

4Shimazaki C，Surnikuma T，Inaba T，etal.CD34+CD90+cells and late hematopoietic reconstitution after autologous periphera1 blood stem cell transplantation 〔J〕.Leuk Lymphoma，2004;45(4)：661-8.

5苗小艳，何菱，贾莉，等.营养组合物对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血细胞线粒体形态及跨膜电位的影响〔J〕.解剖科学进展，2010;16(5)：456-9.

6Lee JW.Tongue-folding and tongue-rolling〔J〕.J Hered，1950;45(1)：176.

〔2014-03-12修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)