沙利度胺对人结肠癌小鼠移植瘤放射敏感性的影响及其机制

王媛惠双

(南阳市中心医院，河南南阳473000)

摘要〔〕目的探讨沙利度胺对人结肠癌小鼠移植瘤放射敏感性的影响及其协同作用的机制。方法建立Colon26肠癌小鼠移植瘤模型，将28只小鼠随机分为对照组、单纯放疗组(R组)、单纯沙利度胺组(T组)、放疗联合沙利度胺组(T+R组)。自治疗当日起，次日测量肿瘤体积，计算肿瘤抑制率，并将小鼠断髓处死后剥离瘤体，采用免疫组织化学法对各肿瘤组织中微血管密度(MVD)进行测量。结果治疗前各组小鼠移植瘤体积之间差异均无统计学意义(P>0.05)；肿瘤体积随治疗时间的延长逐渐变大，对照组小鼠明显大于另外三组(P<0.05)；其中T+R组小鼠移植瘤体积增长最慢，肿瘤生长曲线最为平缓。治疗结束时，各实验组小鼠移植瘤体积均明显小于对照组(P<0.05)；与对照组相比，T组、R组、T+R组抑制率分别为42.1%、47.3%、62.0%。对照组MVD数量最多，分布密集度最高；T+R组MVD数量最少，坏死区域面积最大，移植瘤组织中的MVD表达明显低于另外三组(P<0.05)。结论沙利度胺能够有效增强结肠癌小鼠移植瘤的放射敏感性，其可能机制与抑制移植瘤血管的生成有关。

关键词〔〕结肠癌；沙利度胺；放射敏感性；微血管密度；移植瘤

中图分类号〔〕R735.3+5〔文献标识码〕A〔

通讯作者：惠双(1976-)，男，副主任医师，主要从事肿瘤靶向治疗研究。

第一作者：王媛(1985-)，女，硕士，主要从事肿瘤治疗研究。

目前临床对结肠癌治疗的主要手段包括手术、放疗、化疗，其中放疗是不可或缺的辅助治疗手段，但肿瘤细胞通常对放疗的敏感性较低〔1，2〕。研究发现，沙利度胺可有效提升人食管癌细胞对放疗的敏感性，且与血管内皮生长因子有关〔3〕。但关于沙利度胺在提升结肠癌放疗敏感性的作用效果和机制的研究仍鲜有报道。本次研究采用Colon26肠癌小鼠移植瘤模型，从肿瘤组织血管形成的角度初步探讨抗肿瘤机制，观察沙利度胺的放射增敏效果。

1材料与方法

1.1试剂与仪器沙利度胺，美国Sigma公司产品，批号093K461；RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为美国HyClone公司产品；大鼠抗小鼠CD34/IgG单克隆抗体购于北京翰谱医药生物研究所。放射治疗设备采用Precise Clinac EX Primus型医用电子直线加速器，德国西门子公司产品，TS100型倒置显微镜购于日本尼康公司。

1.2实验动物和细胞株健康雄性BALB/C小鼠28只，6～8周龄，体质量(20±2)g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：僦(京)2005-00130。小鼠结肠腺癌Colon26细胞系由郑州大学提供。

1.3实验方法①模型建立：将结肠腺癌Colon26细胞系体外培养到指数生长期，制成单细胞悬液，取0.3 ml悬液(约含肿瘤细胞1×106)，在小鼠前腿进行皮下注射，共接种28只，均成瘤，成功建立小鼠移植瘤模型。②分组：模型建立后1 w将28只小鼠随机分对照组、单纯放疗组(R组)、单纯沙利度胺组(T组)、放疗联合沙利度胺组(T+R组)，每组7只。对照组给予0.9%氧化钠溶液灌胃，每次0.3 ml，1次/d；R组小鼠在清醒状态下捆绑固定，用6 MVX射线照射，SSD为100 cm，照射剂量为8 Gy，输出率300 mU/min；T组将沙利度胺用0.9%氧化钠溶液溶解，按200 mg/kg剂量灌胃。③肿瘤生长曲线：治疗后次日对肿瘤长径(a)和与其垂直的短径(b)进行测量，估算肿瘤体积，计算肿瘤生长抑制率；饲养第22天时断髓处死小鼠，将肿瘤剥离后放入4%中性甲醛固定液中。④肿瘤生长延迟(TGD)时间和放射增敏比(SER)：各实验组小鼠肿瘤体积增大到开始实验时5倍需要的时间和对照组小鼠肿瘤用时得差值为TGD时间；T+R组TGD时间和R组TGD时间的比值为沙利度胺对照射的SER。

1.4肿瘤细胞坏死程度判断首先在低倍镜下对切片的整体染色情况进行观察，然后在高倍镜下对切片的10个视野进行观察，在每个视野中计数100个重度坏死细胞，计算平均值反应肿瘤组织中的坏死水平。

1.5免疫组化检测微血管密度(MVD)用CD34对血管内皮细胞进行染色标记，阳性细胞未呈浅黄色到深棕色颗粒；可被染色的内皮细胞，只要同周围微血管、相连组织之间有明显的分界线，则作为一个可计数的微血管。取5个高倍镜视野下血管数目的均值。

1.6统计学方法应用SPSS18.0软件行t检验及方差分析。

2结果

2.1各实验组对结肠癌小鼠移植瘤生长的影响治疗前各组小鼠移植瘤体积之间差异均无统计学意义(P>0.05)；肿瘤体积随治疗时间的延长逐渐变大，对照组小鼠明显大于另外三组(P<0.05)；其中T+R组肿瘤体积上升最慢，生长曲线最平缓。与对照组小鼠相比，R组、T+R组小鼠肿瘤体积增加到治疗前五倍时的TCD值分别为6.0、2.7 d，SER值2.32。治疗第22天，各实验组小鼠肿瘤体积均明显小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，T组、R组、T+R组抑制率分别为42.1%、47.3%、62.0%。

2.2肿瘤组织病理形态对照组小鼠肿瘤细胞成片状分布，生长旺盛，肿瘤坏死区极少；T组小鼠肿瘤细胞核体积小，排布紧密，染色质浓缩边集，少数细胞核断裂表现出体积不等的细胞核小体；R组小鼠肿瘤细胞可见少量的组织浓染区和较多的肿瘤坏死区，组织中存在有少数异常肿瘤细胞，呈巢状分布于正常肿瘤细胞间，细胞核浓染、固缩、坏死；T+R组小鼠肿瘤细胞中可见大面积坏死区域，极少数正常肿瘤细胞。见图1。

2.3对MVD表达的影响对照组MVD数量最多，分布密集度最高；T+R组MVD数量最少，坏死区域面积最大，移植瘤组织中的MVD表达明显低于另外三组(P<0.05)。见图2，表1。

图1　光镜下各组小鼠肿瘤组织病理形态(×100)

图2　光镜下各组小鼠肿瘤组织中MVD的表达(×100)

分组MVD坏死细胞对照组37.68±11.3547.89±10.55T组23.87±11.8260.77±7.92R组22.78±10.4161.81±6.37T+R组20.58±11.7064.52±7.35

3讨论

近年来研究显示，沙利度胺能够通过抑制肿瘤血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的分泌，发挥抗血管生成的作用；通过升高自然杀伤(NK)细胞活性和调节T淋巴细胞功能，增强机体的免疫功能，起到良好的抗肿瘤效果〔4〕。抗肿瘤血管生成已经逐渐成为临床中肿瘤治疗新的方案，与放疗相互结合，能够取得较好的治疗效果。临床治疗中选用的特异性抗血管生成药包括恩度、贝伐单抗等，由于价格较高，阻碍了其在经济条件不理想的癌症患者中的推广〔5〕。沙利度胺作为一种成本和售价较低的抗血管生成药，逐渐得到了关注。高MVD者放射敏感性好〔6〕。本次研究显示，沙利度胺与放疗联合使用能够明显抑制结肠癌小鼠移植瘤的生长，抑制效果明显好于沙利度胺与放疗单独使用。本次研究中还发现T+R组小鼠肿瘤生长抑制的程度明显优于T组、R组，而仅仅是两个单独治疗方案相关疗效的简单加和，其原因主要为肿瘤病灶的生成是一个复杂的过程，通过多种因素的共同作用，需进一步深入研究。本次研究中T+R组的MVD明显低于另外三组，说明联合治疗能对结肠癌小鼠移植瘤的血管生成起到明显的抑制作用。其原因除去放射治疗能够将部分肿瘤细胞直接杀死，使肿瘤组织中MVD的表达降低之外，还可能因为沙利度胺能够对肿瘤组织中紊乱的血管网起到较好的改善作用，促使其功能和结构正常化，进而使组织微循环得到改善，提升血液灌注和氧分压，进而提高了放疗的效果。

4参考文献

1刘志岩，赵航.老年结肠癌致肠梗阻103例临床分析〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(10)：1877-8.

2田青山.老年结肠癌23例治疗体会〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(18)：3592-3.

3于静萍，孙志强，倪新初，等.沙利度胺联合放疗治疗食管癌的临床观察〔J〕.中华放射医学与防护杂志，2012；32(4)：369-73.

4赵变锋.沙利度胺抗肿瘤机制及临床研究进展〔J〕.内科急危重症杂志，2011；17(1)：50-1.

5徐玲玲.抗肿瘤血管生成靶向药物的不良反应、发生机制及处理〔J〕.国际肿瘤学杂志，2010；37(3)：196-9.

6张蓓，魏冉，胡文娟，等.乳腺癌新辅助化疗MR灌注成像与微血管密度的相关性研究〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2011；18(17)：1387-91.

〔2015-01-12修回〕

(编辑袁左鸣)