王林果马 军

(1.普莱柯生物工程股份有限公司,河南洛阳 537000; 2.海南大学,海南三亚 570225)

雏鸡关节炎病原菌株分离鉴定及药敏性分析

王林果1马 军2

(1.普莱柯生物工程股份有限公司,河南洛阳 537000; 2.海南大学,海南三亚 570225)

根据鸡胚孵化周期,对南方某公司提供的鸡胚及发病小鸡进行连续21d细菌调查,分别从鸡胚的蛋清、蛋壳、死胚内物质、死胚的肝及关节、发病小鸡的肝及关节中分离可疑细菌,并接种于营养肉汤,培养后进行细菌分离;采用生化特征法鉴定出三种优势细菌分别为大肠杆菌、沙门氏菌及弗劳地氏枸掾酸杆菌。采用K-B法进行药物敏感试验,结果显示三种菌株对复达欣、先锋V、链霉素、庆大霉素、阿莫西林的敏感性达100%;对氯霉素、四环素的敏感性达75%;对利福平、萘啶酸的敏感性达25%。结果表明,对鸡的细菌性疾病,采取预防措施,对症下药是提高经济效益的关键因素。

鸡胚;分离;鉴定;药敏实验

2014年11月中旬，南方某公司孵化场自行孵化的几批次三黄鸡雏鸡1～10日龄大量鸡跛行，并伴有死亡现象，死亡率较高。场方采用添加多种维生素，复合维生素B并用抗菌药物治疗，能较好控制病情继续发展。为搞清楚导致这几批次雏鸡发病的病原，从根本上找到原因解决它，笔者设计一个实验对病原展开调查，现将其结果汇报如下文。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 收集监测材料

活鸡胚，死胚，发病小鸡及死亡小鸡。

1.1.2 主要仪器及药品

生化培养箱，电子天平，光学显微镜，洁净工作台，肠杆菌科细菌生化常规微量鉴定管，药敏鉴定试纸，革兰氏染色试剂盒，缓冲蛋白胨水（BPW），XLD培养基及胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSEA），鉴定培养基。

1.2 方法

1.2.1 细菌调查

取鸡胚的蛋清、蛋壳，死胚的内物质或死胚的肝及关节，小鸡的肝及关节接种于BPW培养基中，于37℃恒温温箱培养24h；取BPW培养基培养物分别划线接种于营养琼脂平板、XLD琼脂平板上，37℃培养24h进行细菌调查[1]，记录细菌的感染情况，并计算每天每个检测项目的细菌感染率。

1.2.2 生化鉴定

生化鉴定项目包括以下项目：糖醇类发酵试验、氨基酸类试验、产硫化氢试验、靛基质试验、苯丙氨酸试验、尿素试验、枸橼酸盐试验。具体操作方法按照说明书进行，记录结果根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定分离的细菌。

1.2.3 病原细菌的生物学特性研究

（1）培养特性 取纯培养物分别接种于XLD平板、胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSEA），37℃培养18～24h观察其培养特性。

（2）革兰氏阳性、阴性染色

1.2.4 病原细菌的药敏试验

按NCCLS抗微生物药物敏感性试验M2-A8标准。本实验采用的菌种都已经经过分离鉴定。取分离纯化的四株菌做药敏实验，测定其耐药性。药敏实验按K-B纸片扩散法进行，将四株菌株接种于1.5mlBPW培养基的EP管中，置于37℃温箱中培养18h[2]，菌液与灭好菌的0.9%生理盐水按1：1000稀释，在普通琼脂平板上均匀涂布，盖上平板，置室温数分钟至培养基表面无明显液体，用无菌小镊子夹取药敏纸片平贴于琼脂平板表面，然后翻转倒置于37℃恒温箱培养24h，测量抑菌环直径并判定。以上所有菌株均做两个重复。把抑菌圈直径的大小作为判定药物敏感性的高低的标准，采用WHO质控标准菌的敏感性及抑菌环大小，采用划分方式报告结果，即敏感、中度敏感和耐药（见表1）。

表1 具体判定标准

2 结果

2.1 细菌感染率调查结果

表2 各项目细菌感染率调查表

由表2可看出，每天随机抽取的鸡胚中，壳的染菌率较高，在50～100%之间浮动；根据鸡胚孵化的生理时间，对鸡胚的细菌调查分两阶段，第一阶段中蛋清部分被染菌，感染率在0～28.6%之间，而蛋黄都未被染菌，第二阶段鸡胚初步成型，染菌率为0～10%之间；死的鸡胚中染菌率也较高，在抽取的生长缓慢或带病小鸡中，肝和关节的染菌率，分别为20～100%和10～100%；由此可知，壳、死鸡胚及小鸡的肝、关节的染菌率较高，鸡胚壳上的细菌通过种鸡的排泄物进行水平传播，鸡胚及死鸡胚中的细菌通过种鸡垂直传播，而小鸡则是通过饮食或周围环境，水平传播或垂直传播。

图1 各项目细菌分离率曲线图

2.2 病原分离结果

从鸡胚壳及鸡胚分离出的可疑细菌菌落形态各异（见图2），图中（a）、（d）分别为第5d、17d从鸡胚壳上分离出的可疑细菌，菌体黄色，圆形湿润，有光泽，不透明；（b）为第11d从鸡胚壳上分离出的可疑细菌，平板上方及左下方菌体黄色，圆形湿润，有光泽，不透明，右下方菌体黑色圆形，有光泽，不透明；（c）为第14d从鸡胚内分离出的可疑细菌，菌体黑色圆形，无光泽，不透明。

图2 鸡胚壳及鸡胚分离出的细菌菌落形态

2.2.1 三种细菌在XLD选择性培养基上的菌落形态

将从鸡胚壳及鸡胚分离出的可疑细菌接到XLD选择性培养基上培养，24h后观察其形态（见图3.2），（a）为细菌A在此培养基上发酵乳糖产酸，在酚红中呈黄色，菌体圆形湿润，有光泽，不透明；（b）为细菌B与培养基中硫代硫酸钠产生H2S，故呈黑色，菌体圆形湿润，有光泽，不透明；（c）为细菌C发酵乳糖产酸，又与培养基中硫代硫酸钠产生H2S，故菌在培养中黑而不亮，表面有一层黄色，边缘也呈黄色。

图3 三种细菌在XLD选择性培养基上的菌落形态

2.2.2 三种细菌在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基上的菌落形态

将从鸡胚壳及鸡胚分离出的可疑细菌接到胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基上培养，24h后观察其形态（见图4），图中（a）为细菌A，菌体乳白色，圆形湿润，有光泽，半透明；（b）为细菌B，菌体乳白色，圆形湿润，有光泽，不透明，菌落直径较小，（c）为细菌C，菌体形态与细菌B相似。

图4 三种细菌在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基上的菌落形态

2.3 细菌菌体形态

对所分离的菌落进行革兰氏染色镜检，三种细菌镜检结果都为革兰氏阴性，图5为细菌A，其菌体形态两极钝圆，短杆状；图5细菌B的菌体形态细杆状，散乱分布；图5 细菌C的菌体形态杆状，且较粗短，均匀分布。

图5 细菌A、B、C菌体光镜下形态.

2.4 细菌的生化鉴定

2.4.1 细菌的生化鉴定结果

表3 生化鉴定结果

2.4.2 三种细菌的鉴定结果

菌A鉴定值为AG440，鉴定结果为大肠埃希氏菌；菌B鉴定值为AG710，鉴定结果为沙门氏菌；菌C鉴定值为AG110，鉴定结果为弗劳地氏枸橼酸杆菌。

2.5 药敏试验

三种菌株的药敏试验，18～24h的试验结果（见图6）

三种菌株的药敏试验，18～24h的试验结果（见图6）

2.5.1 不同药物对不同菌株的抑菌直径

2.5.2 三株菌株对20种药物的耐药与敏感情况

3 分析与讨论

3.1 对细菌性疾病的预防措施

图6 三种菌株的药敏试验结果

表4 三株菌株的抑菌直径（单位：mm）

表1的调查数据表明，壳、死鸡胚及小鸡的肝、关节的染菌率较高，鸡胚壳上的细菌通过种鸡的排泄物进行水平传播，鸡胚及死鸡胚中的细菌通过种鸡垂直传播，而小鸡则是通过饮食或周围环境，水平传播或垂直传播，从而导致鸡的孵化率低、鸡生长缓慢、跛脚甚至死亡等病症，因此疫病的综合性防制和营造良好的饲养环境就成为了养鸡业控制大肠杆菌病的关键所在。我们仅从饮水、饲料和鸡舍这三个方面就轻而易举地说明道理：饮水极易腐败变质，通常养鸡场使用的是贮水式给水器和罐式饮水器，在混入的饲料、尘埃和鸡的唾液等污物的污染下，通常-昼夜细菌会增殖百万倍，尤其是夏季和鸡舍内温度较高的情况下，以及在饮水中添加营养性物质（如维生素等）。在饲料中反映出的问题更为严重，本来大肠杆菌对抗生素类药品就有较强的抗药性，但现在的-些饲料生产企业滥加抗生素，使病原微生物产生的抗药性给预防和治疗都带来极大的困难[3]。另外，饲料厂在生产中原材料品质较差，劣质的原料（鱼粉、骨粉、羽毛粉、血粉等）带入大量的致病菌。鸡舍的环境卫生不好，就可给大肠杆菌的繁衍创造更加良好的条件。在这种情况下诸如湿度、温度、灰尘、酸碱度发生改变时[4]，当饲养水平低下时病鸡就会源源不断地出现，因此，应做到以下预防：

（1）防止水源的污染，注意饮水的卫生和消毒，这是预防本病的重要方面。水槽要经常清洗，必要时可在饮水中加入适当浓度的消毒药，以杀灭饮水中的病源微生物，不但对大肠杆菌病，对其他-些疾病也有较好的预防作用。

表5 三株菌株的药物敏感度

（2）种鸡场要及时收捡种蛋，避免种蛋被粪便污染，在孵化前做好种蛋细菌总数检验，凡被粪便污染的种蛋，一律不得做孵化。

（3）搞好种蛋、孵化器及孵化全过程的清洁卫生及消毒工作，以减少雏鸡感染大肠杆菌病和大肠杆菌病的传播。

（4）注意育雏期间的饲养管理，保持较稳定的温度、湿度，做好饲养管理用具的消毒卫生。

（5）控制鸡群的饲养密度，防止过分拥挤，保持空气流通、新鲜，防止有害气体污染，定期消毒鸡舍、用具及养鸡环境。

3.2 对细菌性关节病的治疗

对细菌性关节病的治疗，最好是做药敏试验后再用药。因时间及条件限制时，可选用几种对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都敏感的药物试用[5]。对重度跛行鸡全部淘汰，对10～30日龄的轻度跛行雏鸡肌注卡那霉素，每只5千至1万单位，经处理后，可以使淘汰病鸡数量随之减少，但确切有效的方法还有待在生产研究中不断发现，不断完善。

本次调查发现鸡沙门氏菌可引起鸡关节炎。沙门氏菌传播的方式有：①经口感染，如通过饲料或饮水；②能垂直传递和水平传播，受感染种蛋，出雏后进横向传播给同群鸡，因幼龄雏鸡敏感，故这一途径极为重要；③间接感染，哺乳动物（包括人），鸟和昆虫等均可为传染源，其中特别重要的使老鼠和甲虫，它们会将病源从一群传播到另一群。因此要对沙门氏菌达到有效防治，就要做到以下几点：①加强饲养管理，如饲料饮水的控制管理，环境对健康鸡肠道菌群的构成起决定作用，控制鸡白痢等疾病应注意环境的净化[6]；②从种鸡场开始，采用有计划的检疫淘汰和综合防治相结合的方法进行净化；③培育无鸡白痢沙门氏菌的种鸡群以切断由蛋循环传递的链锁[7-8]；④消灭传染源，逐步控制和消灭此病。

3.3 耐药性的控制

本试验表4、表5的药敏结果显示在鸡胚壳上及死鸡胚内分离出的四个菌株对甲氧胺嘧啶耐药率达100%；对利福平、萘啶酸的耐药率达75%；对氯霉素、四环素耐药率为25%；对复达欣、先锋V、链霉素、庆大霉素、阿莫西林的敏感性达100%；对氯霉素、四环素的敏感性达75%；对利福平、萘啶酸的敏感性达25%。可见菌株的耐药性达到-个相当的程度。对于该病的控制目前我国各地主要通过使用抗菌药物进行预防和治疗，但是抗菌药物的使用不当或滥用，不仅使成本上升，而且带来了耐药性等-系列问题。

国内外有关研究表明，细菌产生耐药性的机理包括：与抗生素结合靶位改变，使抗生素与细菌亲和力下降，从而使抗生素失活或活性下降；细胞膜通透性的改变，使抗生素进入细菌体内量减少；R质粒在细菌间穿梭，可将耐药基因传入不同的细菌，使细菌获得耐药性。

造成耐药性的原因有很多，如养殖户用药过程中选药、剂量、疗程不当，甚至有不少专业户常常在未确定病因的情况下，大量使用广谱抗菌药，存在严重滥用药物现象[9]；假冒伪劣兽药产品充斥市场，个别兽药厂家的产品有效成分含量不足，名牌中标记的剂量、疗程常不能达到治疗效果，对养殖户的用药起到严重的误导作用。其中最主要的养殖户不规范使用或滥用抗生素，使得很多耐药菌株的产生。

要有效控制耐药性的产生，就要做到以下几点：①在治疗过程中，做药敏实验筛选高敏感药物，增加了选药、剂量、疗程的准确性；②在养殖专业户和养殖场工作人员中进行宣传教育，使其加强饲养管理，合理用药，特别是合理使用抗生素；③制定相关的法律法规，对于制造假冒伪劣兽药产品，误导群众的厂家进行严厉打击，加大力度规范兽药市场。

4 结论

（1）本实验细菌感染调查数据表明，鸡胚壳上的染菌率最高，死鸡胚及小鸡的肝、关节的染菌率次之。分别从第17d的鸡胚壳上、第11d的鸡胚壳上及第14d的死鸡胚内分离出的细菌A、细菌B及细菌C，经镜检及生化鉴定，鉴定出细菌A为大肠杆菌，细菌B为沙门氏菌，细菌C为弗劳地氏枸橼酸杆菌（C.freundii）。

（2）药敏结果显示三个菌株对甲氧胺嘧啶耐药率达100%；对利福平、萘啶酸的耐药率达75%；对氯霉素、四环素耐药率为25%；对复达欣、先锋V、链霉素、庆大霉素、阿莫西林的敏感性达100%；对氯霉素、四环素的敏感性达75%；对利福平、萘啶酸的敏感性达25%。

[1] 李键强，李六金.兽医微生物学实验指导[M]. 陕西：科学技术出版社，1999.

[2] 刘媚，曹文汇，白芳等. 鸡大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的分离鉴定及药敏试验研究[J] .兽医研究，2007，（213）：14-16.

[3] 石优章，徐霞芬，何水渊等.76株沙门氏菌菌型鉴定与耐药性检测[J].浙江预防医学，1998，（6）：383.

[4] 温群文，袁梦，俞幕华等. 三种方法检测沙门氏菌的比较研究[J].中国热带医学，2006，6（11）：1960-1961.

[5] 任广莲.浅谈鸡白痢病的净化与防治[J].禽业科技，1998，14（2）：47.

[6] 代玉林.沙门氏菌的综合控制措施[J] .肉类工业，2003，（11）：35-36.

王林果（1978-），男，禽病学博士，普莱柯生物工程股份有限公司，兽医师。