多重荧光PCR应用于下呼吸道感染病原菌检测的研究

黄松洁 姚艺辉 晁鹏丽

目的应用多重荧光PCR技术检测下呼吸道感染常见病原菌，为下呼吸道感染提供一种高效的诊断工具。方法建立多重荧光PCR法检测下呼吸道感染常见细菌中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌，应用该法检测了112例临床痰标本，并与细菌培养结果进行比对。结果在多重PCR反应体系中，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌的灵敏度为5×102copies/ml，肺炎链球菌的灵敏度为2．5×102copies /ml；多重荧光PCR检测112例临床痰标本，大肠埃希菌阳性率为9．8%，肺炎克雷伯菌阳性率为12．5%，铜绿假单胞菌阳性率为17．0%，肺炎链球菌阳性率为0．9%。结论多重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、通量高和速度快等优点，为下呼吸道感染诊断提供了新的检测手段。

多重PCR；下呼吸道感染；检测

下呼吸道感染是严重威胁人类健康的主要疾病之一，其死亡率居高不下的主要原因是没有获得及时、正确的诊断和治疗。明确下呼吸道感染的病原体对于确立诊断和治疗方案、指导抗生素使用、减少药物副作用、减少病原体耐药、缩短病程以及降低费用等具有重要意义。临床上传统的检测方法，如组织形态学、免疫学和微生物培养鉴定等，存在着实验周期长、灵敏度及特异性较差等缺点。本研究采用采用多重荧光PCR技术检测下呼吸道感染常见细菌中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌。多重PCR（multiplexPCR）［1］具有同时扩增多个目的基因、节省标本、节省时间、降低成本、提高效率的优点得到迅速发展，逐渐在生命科学的各个领域成为一项成熟而重要的研究手段［2］，对于传染病的检测与预防，具有不可替代的作用。

1 资料和方法

1.1 标本来源

痰标本112例，收集自2014年4月~ 2014年10月初诊的社区获得性肺炎患者；标准菌株来源：大肠埃希菌为ATCC25922，肺炎克雷伯菌为ATCC700603，铜绿假单胞菌为ATCC27853，肺炎链球菌为ATCC49619。

1.2 试剂与仪器

DEPC水、DNA提取用细胞裂解液购自凯杰（QIAGEN）生物工程（深圳）有限公司，PCR反应液（master mix）购自fermentas公司，引物及探针由invitrogen公司合成，PCR仪为美国ABI 7500。

1.3 标本处理

痰标本加入1～2倍体积的无菌生理盐水，室温放置约0.5 h至完全液化后进行核酸提取。标准菌株先进行细菌培养，用接种环挑取单个菌落上的少量细菌，加入装有500 μl无菌生理盐水的离心管中，充分混匀。

1.4 核酸提取

采用加热煮沸裂解法：吸取200 μl液化痰标本或标准菌株悬液加入离心管中，13 000 rpm/min离心5 min，吸弃上清，加入200 μl无菌生理盐水，充分震荡后13 000 rpm/min离心5 min，吸弃上清，再加入50 μl裂解液，在恒温加热仪上100℃加热10 min，然后13 000 rpm/min离心5 min，吸取上清并于－20℃保存备用。

1.5 引物、探针设计

采用primer premier 5.0软件设计，然后通过BLAST进行同源性比对以保证其特异性。具体引物、探针设计见表1。

1.6 基因扩增

PCR反应体系：PCR反应总体积为50 μl，其中上述提取的DNA模板2 μl，多重PCR反应液（master mix）25 μl，引物浓度分别为大肠埃希菌引物对0.156 μmol/L，肺炎克雷伯菌引物对0.625 μmol/L，铜绿假单胞菌引物对0.08 μmol/L，肺炎链球菌引物对1.25 μmol/L，各探针浓度均为0.1 μmol/L，以无菌超纯水补足50 μl体系。PCR反应条件：95℃ 10 min，1个循环；95℃15 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。

表1 各菌株引物、探针设计表

1.7 实验灵敏度验证

应用细胞计数板计数将各标准菌液调配出1×104/ml、1×103/ ml、5×102/ml、2.5×102/ml、1.25×102/ml菌液，将各菌液提取DNA后进行PCR扩增，分批至少重复20次检测，至少连续做三次，检出率大于95%的最低浓度值为分析灵敏度。

2 结果

不论是单DNA模板检测还是多DNA模板检测，均得到有效扩增，反应曲线如图1。

在多重PCR反应体系中，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌的灵敏度为5×102copies/ml，肺炎链球菌的灵敏度为2.5×102copies /ml，实验反应曲线如图2。

对112例临床痰标本分别进行细菌培养和多重荧光PCR检测，实验结果多重PCR阳性率稍大于细菌培养阳性率。详见表2。

3 讨论

3.1 检测方法

表2 112例痰标本阳性例数和百分比

目前临床常用的下呼吸道病原菌检测方法有痰涂片革兰氏染色镜检、痰培养、血培养、PCR法等。革兰氏染色镜检方法简单，但难以发现轻中度社区获得性肺炎的病原体且阳性结果的判定缺乏标准［3］。痰培养是目前最常用的诊断方法，但由于人体口咽部存在正常菌群，痰培养得到的细菌不一定是致病菌。定量培养法、半定量培养法能鉴别污染菌和致病菌。一般定量培养细菌数≥104CFU/ml（集落生成单位/ml）有临床意义［4］，另外，连续2次以上分离到同一细菌也可认为是致病菌。血培养的作用目前有一定争议，血培养若检出病原菌，其特异性较高，但敏感性仅为20%［5］。应用PCR技术检测痰标本的病原菌，具有速度快、敏感度较高、特异性好的优点，但痰标本存在PCR反应抑制物，在DNA提取过程中若不能有效去除抑制物，将影响PCR的灵敏度。

3.2 实验分析

本实验采用多重PCR方法，其基本原理与常规PCR相同，但实际反应远比常规PCR复杂。首先，多重PCR 反应体系中同时存在几对引物， 容易形成引物二聚体。另外，对某个靶序列的优先扩增（preferential amplification）是多重PCR中普遍存在的问题，目前的观点认为这主要是由于PCR 漂移（PCR drift）和PCR 选择（PCR selection）造成的［6］。在实验中，从引物及探针设计、各引物浓度、退火及延伸的温度和时间、扩增循环次数等方面对实验进行优化，以保证多重PCR的灵敏度和特异性，并尽量使多重扩增的效率趋于一致。本实验灵敏度符合临床要求，多重PCR阳性率稍大于细菌培养阳性率，考虑为培养法灵敏度低于PCR法，亦不排除患者在初诊前自行服用抗生素，抑制了细菌的生长。

图1 各病原菌荧光PCR扩增曲线图

图2 各病原菌灵敏度实验的荧光PCR扩增曲线图

3.3 结论和展望

本实验建立的多重荧光PCR检测方法具有多通量、灵敏度高、特异性强、检测不受抗生素影响等优点，为下呼吸道感染诊断提供了新的检测手段，并为其临床应用提供了良好的实验基础。本实验亦具有局限性，首先，PCR法不能区分是活动性感染还是潜伏性感染；另外，目前荧光PCR仪最多只有5个检测通道，限制了本实验的检测通量，如在扩增时分管检测，则可以进一步提高实验的检测通量。

［1］Chambercian J S，Gibbs R A，Ranier J E，et al．Detection screening of the duchenne muscular dystrophy locus via mutiplex DNA amplification［J］． Nucl Acids Res，1988，16（16）：1141-1156．

［2］Ponce M R，Robles P，Micol J L．High-throughput genetic mapping in Arabidopsos thaliana［J］．Mol Gen Genet，1999，261（2）：408-415．

［3］Theerthakarai R， Halees W， Solis R A， et al． Nonvalue of the initial microbiological studies in the management of nonsevere community- acquired pneumonia［J］．Chest，2001，119（1）：181-184．

［4］叶应妩，王毓三，申子瑜． 全国临床检验操作规程［M］．3 版．南京：东南大学出版社，2006，10：745．

［5］Luna C M， Videla A， Mattera J， et al． Blood cultures have limited value in predicting severity of illness and as a diagnostic tool in ventilator-associated pneumonia［J］． Chest，1999，116（4）：1075-1084．

［6］Elnifor E M，Ashshi A M，Cooper R J， et al．Multiplex PCR：Optimization and Application in Diagnostic Virology［J］．Clin Microbiol Rev，2000，13（4）：559-570．

Detection of Pathogenic Bacteria in Lower Respiratory Tract Infection by Multiplex Fluorescent PCR

HUANG Songjie YAO Yihui CHAO Pengli Clinical laboratory，Zhongshan Hospital affiliated with Xiamen University，Zhongshan 361004，China

ObjectiveTo establish a highly efficient technique of diagnosis to detect common Pathogenic bacteria leading to lower respiratory tract infections using multiple fluorescence PCR technique．MethodsUsing multiple fluorescent PCR to detect common bacteria leading to the lower respiratory tract infection such as e． coli， klebsiella pneumoniae， pseudomonas aeruginosa and s． pneumonia in the 112 samples of clinical sputum specimens， and compare with the results of bacterial culture．ResultsThe sensitivity of the test by multiple PCR method for e． coli，klebsiella pneumonia and pseudomonas aeruginosa was 5 × 102copies/ml， and for streptococcus pneumonia was 2．5 × 102copies/ml． In 112 sputum specimens collected from clinical respiratory tract infection， the positive rate of e． coli klebsiella pneumonia， pseudomonas aeruginosa and streptococcus pneumonia were 9．8%， 12．5%， 17．0% and 0．9% respectively．ConclusionMultiplex fluorescent PCR detection method has the advantages of high sensitivity， high specificity， high throughput and high speed． It provides a new detection method for the diagnosis of lower respiratory tract infections．

Multiplex PCR，Lower respiratory tract infection，Detection

R56

A

1674-9316（2015）29-0155-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．29．115

361004厦门大学附属中山医院检验科 基金项目：福建省卫生厅青年基金（2010-2-95）