李 锵，张 健，王伦兴，王召贺，杨再昌，2*

(1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025;2.贵州大学药学院，贵州贵阳550025)

结核是由结核杆菌引起的传染病，全世界范围内每年约有300万人死于结核。同时，艾滋病患者免疫功能下降，更易感染结核杆菌［1-2］。目前，世界上约1/3的人口已感染了结核杆菌［3-4］，约5千万人感染耐药结核杆菌［5-6］。结核杆菌耐药后，现有抗结核药物很难杀死耐药菌株。因此，寻找新型抗结核杆菌活性物质具有重大意义。

最早的抗结核药物链霉素来自于放线菌，经过几十年的筛选挖掘，似乎已很难从普通土壤中发现新的抗菌素生产菌。国内外近年来在抗结核药物研发方面主要走化学合成的路子，但是成效并不明显。

放线菌是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物。目前从微生物中发现的8 000多种微生物活性物质中，有近70%是放线菌产生的［7］。但是，目前人们分离到的放线菌仅占土壤中所有放线菌的10%左右［8］。自然界丰富的放线菌资源仍具有发现新型抗结核药物的潜力。贵阳市花溪区属于喀斯特地貌，其淡水资源丰富，从该区域的淡水底层土壤中分离到24株放线菌，其中的G2株具有抗结核杆菌活性。笔者报道了该菌株的分离、鉴定和抗结核活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。供试G2菌株分离自贵阳市花溪区地表淡水底层土壤。

1.1.2 培养基。高氏1号培养基［9］;浙江省结核病防治所改良罗氏培养基。

1.2 放线菌分离 采用稀释平板涂抹法［10］分离。将所取土壤样本用无菌水稀释，使用加入苯酚溶液(抑制细菌和真菌的生长)的高氏一号培养基(每100 ml高氏一号培养基中加入2滴浓度10%的苯酚溶液)来分离样本中的放线菌。28℃恒温培养7 d，划线分离直至纯化。

1.3 放线菌鉴定

1.3.1 生理生化特征。参照文献［11］的方法进行。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析。将斜面保藏的菌种活化，接种到高氏一号液体培养基［12］，接种后放置摇床中培养。摇床转速为200 r/min，28℃恒温培养7 d。用试剂盒提取细菌基因组DNA。扩增采用的引物正向为5＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT＇3＇(7F)，反向为 5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇(1540R)。PCR 采用 20～50 ng/μl反应体系，在94 ℃预变性4 min，进入循环扩增阶段，98℃变性25 s，55℃复性25 s，72℃延伸1 min，循环30次，最后在72℃修复延伸10 min，4℃终止反应。在反应结束后，PCR产物经浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测、回收，并且进行序列测定。所测序列用Blast软件与Genebank数据库中已登录的16S rRNA序列进行比对，并且用MEGA6软件进行系统进化树的构建，从而确定G2菌株的同源性。

1.4 抗结核活性测定

1.4.1 培养基。改良罗氏培养基。

1.4.2 培养液萃取。将高氏1号液体培养基中放线菌G2培养液过滤，得到滤液。先用等体积石油醚萃取，回收石油醚得石油醚萃取物;再用等体积乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物;剩余物蒸干。

1.4.3 含药培养基制备。用二甲基亚砜(DMSO)将上述萃取物和剩余物配成10 mg/ml母液，然后将母液与改良罗氏培养基混合，得到含不同样本浓度的含药培养基。每个样本平行作3次，以DMSO作溶剂对照，以异烟肼作阳性作药物对照。

1.4.4 培养与观察。将结核杆菌(H37Rv)悬液(1×107cfu/ml)10 μl接种在斜面含药培养基表面，于37℃培养箱中培养14 d，菌落数小于5个的最小浓度定为样本抑制结核杆菌的MIC值。

2 结果与分析

在高氏1号培养基中，28℃划线培养7 d后，菌落呈白色，不透明，最初表面相当光滑，然后发育一层短菌丝体，可能呈颗粒状、绒状或毛状，干燥，不易挑起(图1A)。革兰氏染色呈紫色(图1B)，为革兰氏阳性菌。菌株G2的主要生理生化特征与白浅灰链霉菌基本保持一致。

凝胶电泳分析结果(图2)显示，扩增的DNA片段S1911在约1 500 bp(base pair)处有一条明亮的PCR特征性条带，用Applied Biosystems 3730XL测序软件得出该菌株的DNA序列为CTGGCTCAGG-GGACGAAGTC，长度为1 461 bp。

将所测序列与NCBI上已登录的同属16S rRNA序列进行比对。由图3可知，G2菌株与登录号为DQ491194的菌株Streptomyces albogriseolus;B191(白浅灰链霉菌)的同源性最高，达到97%。

根据G2菌株的菌落、细菌形态和生理生化特性，结合16s rRNA进行序列比对结果，将G2菌株鉴定为白浅灰链霉菌。

G2菌株培养液经分段萃取后，得到石油醚、乙酸乙酯萃取物和萃取后的剩余物。从表1可以看出，G2菌株培养液的乙酸乙酯萃取物和萃取后剩余物具有抗结核杆菌的活性，乙酸乙酯萃取物和剩余物的MIC值分别为为400和800 μg/ml，石油醚萃取物无活性，可见其活性成分应为具有一定极性的小分子化合物。

表1 G2菌株培养液抗结核杆菌活性

3 讨论

全世界每年约有140万人死于结核病，尤其是耐药结核杆菌感染，对人类健康构成重大威胁。因此，研发新的抗结核药物任务艰巨。G2菌株属白浅灰链霉菌。许多白浅灰链霉菌能产生一种或多种抗细菌、抗真菌、抗藻类、抗病毒、抗原生动物或抗肿瘤的抗菌素。有报道指出，白浅灰链霉菌发酵物乙酸乙酯提取物具有较强的抗肿瘤活性［13］。李晓玲［14］研究表明，红树植物来源的白浅灰链霉菌MGR072蕴藏着丰富的生物碱类次生代谢产物，是寻找药物先导化合物的重要资源。但迄今为止，有关浅灰白链霉菌次生代谢产物抗结核杆菌方面的研究不多。结果表明，G2培养液的乙酸乙酯萃取物具有抗结核杆菌活性，G2菌株分离自淡水底层土壤。这一发现提示具特殊地貌的土壤放线菌具有进一步挖掘新型抗结核药物的潜力。G2菌株发酵液的乙酸乙酯萃取物成分极其复杂，其抗结核杆菌的活性弱可能与有效成分含量不高有关。虽然萃取后剩余物也显示出抗结核杆菌活性，很有可能是萃取不彻底造成的，当然并不排除剩余物存在不同于乙酸乙酯萃取物的活性成分。笔者拟对G2菌株的乙酸乙酯萃取物进行活性跟踪分离，得到活性单体，并且进行结构鉴定和作用机制探讨，相关工作正在进行中。

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