张占军，王富花，曾晓雄

（1.扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；3.扬州工业职业技术学院，江苏扬州225127）

薤白多糖抑瘤及神经营养活性研究

张占军1，2，王富花3，曾晓雄2

（1.扬州市职业大学生物与化工工程学院，江苏扬州225009；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；3.扬州工业职业技术学院，江苏扬州225127）

采用MTT法对薤白多糖纯化组分（AMP40-1、AMP40-2）在体外抑制人肺癌细胞A549和人胃癌细胞BGC-823的增殖作用进行了研究。结果显示，AMP40-2对人肺癌细胞A549的生长具有一定的抑制作用。对人胃癌细胞BGC-823的增殖实验结果表明，薤白多糖AMP40-1、AMP40-2均能不同程度的抑制BGC-823细胞的增殖，且抑制作用与多糖之间存在不同程度的正相关量效关系和时效关系。通过大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12培养体系，对薤白多糖纯化组分（AMP40-1、AMP40-2）进行了神经营养活性研究。结果表明，薤白多糖AMP40-2对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞具有一定的促分化作用。

薤白多糖；癌细胞；增殖；神经营养活性

多糖是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的多聚物，广泛分布于自然界中，是一类重要的活性物质。我国对多糖研究起步较晚，但随着近年来生物学、化学等学科的飞速发展，我国对多糖及其复合物的研究越来越深入。多糖的生物活性受单糖组成、分子量、结构及蛋白质、糖醛酸及硫酸基的含量等方面的影响较大[1-3]，使得多糖的活性呈多样化。有关多糖抗肿瘤活性的报道较多，普遍认为以（1→3）-β-D-葡聚糖和以（1→4）-β-D-葡聚糖占优势的多糖具有明显的抗肿瘤活性[4]；神经营养因子因其对神经系统具有重要的生物学调节作用，而有望用于治疗神经系统疾病，已报道的神经营养因子大多为蛋白质，具有神经营养活性的多糖报道较少，已报道的具有神经营养活性的多糖如刺梨多糖[5]和土党参多糖[6]等。

葱属植物（Allium）属百合科多年生草本植物，具有独特的葱蒜味。全世界己发现葱属植物700多种，我国葱属植物资源丰富，约有110多种，具有适应性强，生存环境广的特点。薤白为葱属多年生草本植物，多食用，其干燥鳞茎也可入药。截至目前，国内外有关薤白的研究多集中于小分子物质，其药理活性主要有抑制血小板聚集，抗抑郁[7]，抗菌，抗癌，解痉平喘[8]，镇痛和耐缺氧以及降血糖、降血脂[9]等。而对薤白多糖药理活性方面的研究较少。为了解薤白多糖的生理活性，正确评价薤白中的功效成分，本研究对薤白多糖抑制癌细胞增殖以及神经营养活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

薤白（野白头）购于安徽慧隆中药饮片有限公司。

薤白多糖40%醇沉组分（AMP40-1、AMP40-2）按照文献[10]所述的分离纯化方法进行制备。

1.2 菌种及细胞株

人胃癌BGC-823细胞株，人肺癌A549细胞株，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株均由南京农业大学食品科技学院细胞实验室提供。

1.3 主要仪器及试剂

3111型Thermo Scientific Forma CO2培养箱：美国Thermo公司；96孔细胞培养板：美国Corning公司；Synergy-2型多功能酶标仪：美国 BioTek公司；NikonTS-100F倒置相差显微镜：日本尼康公司；GRP-9080型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；SW-CJ-IBU型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；Series II 3110型细胞培养箱：美国Thermo Scientific公司；DMEM培养基、新生小牛血清、丙酮酸钠溶液、HEPES试剂购自Gibco公司；噻唑蓝（MTT）、0.25%EDTA-胰酶、神经生长因子（NGF）、青霉素-链霉素贮存溶液为Sigma产品。二甲基亚砜（DMSO）、营养琼脂及牛肉膏、胆盐、磷酸氢二钾、蛋白胨、氯化钠均为国产分析纯试剂。

1.4 方法

1.4.1 薤白多糖的体外抑制肿瘤细胞增殖活性研究

薤白多糖对人肺癌细胞A549及人胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用按照Mosman[11]和Sheng等[12]报道的方法稍有修改。

1.4.1.1 人肺癌细胞A549及人胃癌细胞BGC-823的培养

A549和BGC-823细胞株冻存管解冻后，将冻存液无菌转移至含有5mLDMEM完全培养基中离心10min，倾去上清部分，沉淀部分加10mLDMEM完全培养基制取细胞悬浮液，并转移至细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。待贴壁生长良好后，水平轻微摇晃并吸干培养液，加入适量胰酶（以液面盖住细胞为宜），37℃条件下放置2min～3min，显微镜观察使细胞消化适度，随即吸干消化液，加入适量完全DMEM培养基，用吸管反复吹打成单细胞悬液。将以上细胞按需要稀释后接种于新的细胞培养瓶中培养，每2天～每3天左右传代一次以保持细胞处在对数生长期。

1.4.1.2 细胞接种

取处于对数生长期的A549和BGC-823细胞按上述方法酶解、细胞计数法调整细胞数约为1×105个/m L（A549细胞为5×104个/mL），然后接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL。以纯DMEM完全培养基作为调零孔，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱预培养24h。

1.4.1.3 薤白多糖样品对A549和BGC-823细胞增殖的抑制作用

以薤白多糖纯化组分（AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1和AMP80-1）为实验样品，对分别接种A549和BGC-823的细胞培养板预培养24 h后进行加样处理，用排枪每孔吸去50μL培养液。实验设正常对照组和不同浓度（25、50、100、200、400μg/mL）的样品组。正常对照组每孔加50μLDMEM培养液；样品组分别加入终浓度为25、50、100、200、400μg/mL的薤白多糖纯化组分溶液（用新鲜DMEM完全培养基溶解）各50μL/孔。人肺癌细胞A549培养72 h，人胃癌细胞BGC-823分别培养24、48、72 h后，加入10μL 5mg/mLMTT溶液，继续培养4h后，小心移去培养液，每孔加入100μL DMSO溶液溶解蓝紫色结晶。水平晃动摇匀后，用酶标仪测定550 nm波长下的各孔的光吸收值（Abs），检测不同多糖样品对肿瘤细胞的抑制情况，按下式计算多糖对肿瘤细胞的抑制率：

1.4.2 薤白多糖神经营养活性研究

薤白多糖对PC-12细胞的神经营养活性按照Buchet[13]和Wu[14]等报道的方法略作修改。

1.4.2.1 PC12细胞的培养

PC12细胞采用高糖85%DMEM加12%胎牛血清、3%的马血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养液，置于37℃的5%CO2培养箱中培养，每2天～每3天换液一次，待单层细胞生长到约80%汇合后进行传代培养。

1.4.2.2 细胞接种

将对数生长期的PC12细胞接种于96孔细胞培养板中（培养液为3%的马血清，12%胎牛血清，85% DMEM），调整每孔细胞数约为1×104，在37℃，5%CO2条件下预培养16 h。

1.4.2.3 薤白多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用

以薤白多糖纯化组分（AMP40-1、AMP40-2）为实验样品，对接种PC12的细胞培养板进行加样处理。吸去原培养液，分别加入终浓度为20μg/mL的薤白多糖样品（AMP40-1、AMP40-2），终体积为200μL。同时实验设对照组和NGF对照组（NGF终浓度为100 ng/mL）。在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3天～每4天换液1次，连续培养14 d。定期用倒置显微镜观察细胞生长情况，其中神经突起长度超过胞体直径2倍以上的细胞被记为分化细胞。

2 结果与分析

2.1 薤白多糖的体外抑制肿瘤细胞增殖活性

2.1.1 薤白多糖作用48 h对人肺癌细胞A549生长的抑制作用

薤白多糖40%醇沉纯化组分AMP40-1、AMP40-2对人肺癌细胞A549生长的抑制作用如图1所示。

图1 薤白多糖作用48小时对人肺癌细胞A 549生长的抑制作用Fig.1 Effectof AMPon grow th inhibition of human lung carcinoma A549 cells for 48 hours

从图1可以看出，AMP40-1未发现对人肺癌细胞A549的生长有抑制作用，而AMP40-2对人肺癌细胞A549的生长具有一定的抑制作用，且在实验范围内其抑制作用与浓度呈明显的浓度依赖效应。

根据文献报道，多糖对人肺癌细胞A549生长的抑制率普遍较低，如Sheng等[12]报道的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）多糖CPPSIa在浓度600μg/mL作用48 h后对A549的抑制率也只有37.6%；Ye等[15]报道的马尾藻多糖组分SPP-3-1与SPP-3-2的抑制率在浓度为 1.0 mg/mL时抑制率分别为64.81%和66.99%。相比其它多糖，薤白多糖AMP40-2在浓度400μg/mL作用48 h后抑制率能达到27.52%，表明其对人肺癌细胞A549具有较好的抑制活性。与AMP40-1相比，AMP40-2对人肺癌细胞A549的抑制作用存在明显的差异，这可能是由于在分子量、单糖组成、糖连接方式及糖醛酸含量等方面的差异造成的。

2.1.2 薤白多糖对人肺癌细胞BGC-823生长的抑制作用

薤白多糖40%醇沉纯化组分AMP40-1、AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823作用24小时后增殖的影响如图2所示。

图2 薤白多糖作用24小时对人胃癌细胞BGC-823生长的抑制作用Fig.2 Effect of AM P on grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 24 hours

从图2可以看出，纯化组分AMP40-1和AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823的生长具有一定的抑制作用，其中AMP40-2的抑制作用与浓度在一定范围内呈明显的正相关量效关系。AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用在浓度400μg/mL作用24小时后抑制率达到29.88%，显著要高于AMP40-1的7.38%。

薤白多糖 40%醇沉纯化组分 AMP40-1和AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823作用48h后的抑制作用如图3所示。

图3 薤白多糖作用48小时对人胃癌细胞BGC-823生长的抑制作用Fig.3 Effectof AMPon grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 48 hours

从图3可以看出，纯化组分AMP40-1和AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823的生长均起到一定的抑制作用，且组分AMP40-1、AMP40-2的抑制作用与浓度在实验范围内呈明显的正相关量效关系。与作用24 h一样，AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用明显强于其它组分，在浓度400μg/mL时，它们对BGC-823细胞的抑制率分别为72.01%和48.46%。

薤白多糖纯化组分AMP40-1、AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823作用72 h后的抑制作用如图4所示。

图4 薤白多糖作用72小时对人胃癌细胞BGC-823生长的抑制作用Fig.4 Effect of AM P on grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 72 hours

从图4可以看出，40%醇沉纯化组分AMP40-1和AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823的生长均具有一定的抑制作用，且AMP40-1和AMP40-2的抑制作用与浓度在实验范围内呈明显的正相关量效关系。与作用24、48 h一样，AMP40-2对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用明显强于AMP40-1，在浓度400μg/m L时，它们对BGC-823细胞的抑制率分别达到85.95%和52.63%。此结果也进一步表明薤白多糖对人胃癌细胞BGC-823的抑制作用的强弱与其多糖分子量的大小、糖醛酸含量以及单糖组成等因素存在明显的对应关系。

2.2 薤白多糖对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的分化作用

通过大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12培养体系，以NGF为阳性对照，分别加入薤白多糖后连续培养14 d后在相差显微镜下观察细胞形态，并进行显微照相，实验结果如图5所示。

图5 薤白多糖对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分化的影响Fig.5 Effect of AM P on differen tiation of ratadrenal pheochrom ocytoma PC12 cells

PC12细胞模型常被用于研究神经元的发育、分化和功能。PC12细胞表面分布有丰富的NGF受体，该细胞受到NGF样活性物质刺激后会停止细胞分裂，长出神经突起，成为交感神经细胞元样的细胞[5]。从图5可以看出，AMP40-1和空白对照组细胞呈球形，均未长出突起，AMP40-2部分长出神经样纤维，NGF阳性对照组大量长出神经样纤维。说明薤白多糖AMP40-2对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞具有一定的促分化作用，即AMP40-2具有神经营养活性。

3 结论与展望

肿瘤是当今世界直接危及人类生命的一种最常见、最严重的疾病，因而如何有效地预防和治疗肿瘤已成为医学领域研究的一个热点[16]。19世纪60年代Chihara首次报道了有关大型真菌多糖的抗癌活性，此后，研究人员陆续分离得到了各种结构的具有较强抗肿瘤活性的多糖。不同于传统的抗癌药物，这些物质是通过激活机体各种免疫反应来产生抗肿瘤作用，因此对机体并不会造成伤害[17]。本研究发现薤白多糖对人胃癌细胞BGC-823存在较强的抑制作用，由于AMP40-1和AMP40-2在分子量大小、糖醛酸含量及单糖组成等方面存在着较大区别，结果也进一步表明了多糖抗癌活性的强弱与上述因素存在明显的对应关系。另一方面，根据文献报道，目前神经营养因子大多为蛋白质类物质，有关多糖的神经营养活性报道的并不多，尽管相对于NGF，薤白多糖AMP40-2的神经营养活性还较弱，但通过多糖神经营养活性的研究，对于丰富神经营养因子类物质的认识以及开发多糖的新用途具有重要意义。

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The An titum or Activity and Neurotrophic Activity of Polysaccharides from Allium macrostemon Bunge

ZHANGZhan-jun1，2，WANGFu-hua3，ZENGXiao-xiong2
（1.College of Biologicaland Chemical Engineering，Yangzhou VocationalUniversity，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.Collegeof Food Science and Technology，Nanjing AgriculturalUniversity，Nanjing 210095，Jiangsu，China；3.Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

MTTassaywasused to investigate the anti-proliferation activitiesagainsthuman gastric cancer cells（BGC-823）and human lungadenocarcinoma epithelialcells（A549）in vitroof AMP40-1 and AMP40-2.The results showed that AMP40-2 inhibited proliferation of A549 in a dose-dependentmanner.For human gastric carcinoma cell BGC-823，AMP40-1 and AMP40-2 significantly inhibited proliferation in dose-dependentand time-dependent manner.The neurotrophic activity of polysaccharides from A.macrostemon Bunge were investingated by PC12 cell assay.The screening results showed that AMP40-2 induced the differentiation of PC12 celland hasobviousneurotrophic activity.

polysaccharide from Allium macrostemon bunge；cancer cells；proliferation；neurotrophic activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.026

2013-12-09

江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（BK20141269）；江苏省高校“青蓝工程”（苏教师[2012]39号）

张占军（1977—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品生物技术。