刘胜男，巩卫东，张国庆，卫星，帅瑾

（三门峡出入境检验检疫局，河南三门峡 472000）

HPLC法测定浓缩果汁多菌灵含量的不确定度评定

刘胜男，巩卫东，张国庆，卫星，帅瑾

（三门峡出入境检验检疫局，河南三门峡 472000）

根据方法SN/T 1753-2006《进出口浓缩果汁中噻菌灵、多菌灵残留量检测方法高效液相色谱法》，建立高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定浓缩果汁中多菌灵含量不确定度的数学模型，通过对整个测定过程中各种不确定度因素的研究，分析该测定方法不确定度的来源并对其进行评定，确定不确定度分量，合成不确定度。结果表明：当多菌灵含量为0.045mg/kg时，其扩展不确定度为0.004 4mg/kg（k=2）。其中标准溶液的配制、样品处理操作过程对测量不确定度影响较大。通过对测量不确定度的评定，为有效地控制浓缩果汁中多菌灵含量的检测质量提供可靠的理论依据。

不确定度；多菌灵；高效液相色谱（HPLC）；浓缩果汁

测量不确定度指表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数[1]。近年来，随着科学技术的发展，为了提高样品检测的准确性和检测结果的可靠性，要求报告测量结果时，必须用不确定度来确定测量结果的可信程度[2]。国际标准ISO/IEC 17025-2005《检测和校准实验室能力认可准则》中将不确定度评估作为测试和校准方法及方法验证的一个重要技术要求，并规定实验室应建立相应的不确定度评估程序，以实现检测结果的国际互认[3]。多菌灵是一种内吸性杀菌剂，可被植物吸收并经传导转移到其他部位，干扰病菌细胞的有丝分裂，抑制其生长，主要用于防止蔬菜、水果、粮食等多种真菌病害，还可用于水果保鲜。多菌灵化学性质稳定，在自然环境中降解较慢，且具有一定毒性，能持久保留在果蔬中，若使用不当，会在果蔬及由果蔬制成的果蔬汁中残留[4]。我国及国际上各国对果汁中多菌灵的残留量都十分重视，因此，对果汁中多菌灵的监测已成为一项重要的常规检测项目。本文依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[1]和CNAS-CL 06《化学分析中不确定度的评估指南》[2]规定的基本方法和程序，参照SN/T 1753-2006《进出口浓缩果汁中噻菌灵、多菌灵残留量检测方法高效液相色谱法》，对浓缩果汁中多菌灵残留测定引起的不确定度进行分析评定，找出影响测定结果的各主要分量，在实际操作中可用于指导分析人员进行重点控制，从而提高测定结果的准确性和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓缩苹果汁（三门峡缘份果业有限公司）；多菌灵农药标准品 Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色谱纯）迪马公司；乙腈（色谱纯）迪马公司；磷酸盐缓冲液（0.02mol/L，pH6.8，1.38 g磷酸二氢钠和1.41 g磷酸氢二钠溶于900mL水中，用稀氢氧化钠或稀磷酸调pH=6.8，定容

式中：X为试样中多菌灵的含量，（mg/kg）；A为样液中多菌灵的峰面积；C为标准溶液中多菌灵的浓度，（μg/mL）；V3为试样净化液最后定容体积，mL；m为称取试样的质量，g；AS为标准溶液中多菌灵的峰面积；V2为净化用提取液体积，mL；V1为试样提取液总体积，至1 000m L）；混合固相萃取小柱（PLEXA PCX固相萃取柱，3CC，60mg）：安捷伦公司。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）：美国安捷伦公司；PL403-IC电子天平：梅特勒公司；STARTER 3C酸度计：奥豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 分析步骤

称取2.5 g浓缩果汁，加水稀释，振荡混匀并定容至25mL。将该稀释液转移到150mL锥形瓶中，用2mol/L氢氧化钠调pH=10后，倒入50mL聚丙烯塑料离心管中以8 000 r/min离心10min，取上清液待净化。

准确吸取10.0mL离心上清液上混合固相萃取小柱，依次用2mL 0.15mol/L氨水、2mL氨水（0.15mol/L）―甲醇溶液、2mL 0.1mol/L盐酸、3mL甲醇淋洗柱子，弃去淋洗流出液，整个淋洗过程的流速控制在3mL/min以内。最后用3mL氨水（0.3mol/L）―甲醇溶液洗脱柱子，收集洗脱液，于45℃水浴用微弱的氮气吹干。用1.0m L流动相溶解残渣，经0.45μm滤膜过滤后，供液相色谱分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液+乙腈（80+20），使用前经0.45μm滤膜过滤；流速1.0mL/min；检测波长288 nm；柱温25℃；进样量20μL。

1.4 数学模型

浓缩果汁中多菌灵残留量的计算公式见式（1）：mL；frec为回收率校正因子。

2 测量不确定度的来源

测量方法的主要步骤为称量取样，待测样品的提取、定容、标准系列的配制、仪器分析。由式（1）可知，实验的测量不确定度主要来源有以下几个方面：

1）样品称量引入的不确定度urel（m）；

2）试样提取液总体积引入的不确定度urel（V1）；

3）净化用提取液体积引入的不确定度urel（V2）；

4）试样净化液最后定容体积引入的不确定度urel（V3）；

5）标准溶液中多菌灵的浓度引入的不确定度urel（C）；

6）标准工作溶液峰面积测量引入的不确定度urel（AS）；

7）样品中多菌灵峰面积测量引入的不确定度urel（A）；

8）回收率引入的不确定度urel（frec）；

9）测量重复性产生的A类不确定度urel（w）。

3 不确定度的评定

3.1 样品称量引入的不确定度urel（m）

称量的不确定度来源为：称量的重复性和天平校准产生的不确定度分量。天平校准有两个潜在不确定度来源，即天平的灵敏度以及线性，因称量是用同一天平，在很窄的范围内进行，灵敏度可以忽略[5]。

3.1.1 称量重复性引入的不确定度u1（m）

由天平检定证书得到天平重复性误差为0.001 g，服从矩形分布，k=，转化为标准不确定度为u1=0.577×10-3（g）。

3.1.2 天平校准引入的不确定度u2（m）

由天平说明书得到电子天平的线性误差为±0.002 g，服从矩形分布，k=，转化为标准不确定度u1（m）==0.115×10-2（g）。

样品称样量为2.500 g，综上得到样品称量引入的相对标准不确定度为urel（m）== 0.515×10-3。

3.2 试样提取液总体积引入的不确定度urel（V1）

3.2.1 容量瓶校准引入的不确定度u1（V1）

使用检定合格的25mLA级容量瓶定容，按照《常用玻璃量具检定规程JJG 196-2006》，其最大容量允差为±0.03 m L，按矩形分布，k=，则标准不确定度u1（V1）==0.017 3（mL）。

3.2.2 温度变化引入的不确定度u2（V1）

容量瓶是在20℃温度下校准为25.00mL，假设温差为±3℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，产生的体积变化为：±（25×3×2.1×10-4）=0.015 8mL，按矩形分布，k=，则标准不确定度u2（V1）== 0.009 12（mL）。

综上得到体积V1的合成标准不确定度u（V1）==0.019 6（mL），转化为相对标准不确定度为urel（V1）==0.784×10-3。

3.3 净化用提取液体积引入的不确定度urel（V2）

3.3.1 分度吸量管校准引入的不确定度u1（V2）

使用检定合格的10mL分度吸量管，按照《常用玻璃量具检定规程JJG 196-2006》，其最大容量允差为±0.05mL，按矩形分布，k=，则标准不确定度u

1（V2）==0.028 9（mL）。

3.3.2 温度变化引入的不确定度u2（V2）

量器校准是在20℃温度下进行，假设温差为±3℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，产生的体积变化为：±（10×3×2.1×10-4）=0.006 30mL，按矩形分布，k=，则标准不确定度u2（V2）==0.003 64（mL）。

综上得到体积V2的合成标准不确定度u（V2）==0.029 1（mL），转化为相对标准不确定度为urel（V2）==0.291×10-2。

3.4 试样净化液最后定容体积引入的不确定度urel（V3）

3.4.1 移液器校准引入的不确定度u1（V3）

使用检定合格的1.0mL移液器，按照《移液器检定规程JJG 646-2006》，其容量允差为±1.0%，按矩形分布，k=，则标准不确定度u1（V3）== 0.005 77（mL）。

3.4.2 温度变化引入的不确定度u2（V3）

量器校准是在20℃温度下进行，假设温差为±3℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，产生的体积变化为：±（1.0×3×2.1×10-4）=0.000 630mL，按矩形分布，k=，则标准不确定度u2（V3）==0.000 364（m L）。

综上得到体积V2的合成标准不确定度u（V3）==0.005 78（mL），转化为相对标准不确定度为urel（V3）==0.578×10-2。

3.5 标准溶液中多菌灵浓度引入的不确定度urel（C）

3.5.1 有证标准物质引入的不确定度u1rel（C）

多菌灵标准物质由Dr.Ehrenstorfer公司提供，其扩展不确定度为±0.5%，包含因子k=2，纯度为99.5%，其相对标准不确定度u1rel（C）=）/99.5%= 0.251×10-2。

3.5.2 标准物质称量引入的不确定度u2rel（C）

3.5.2.1 称量重复性引入的不确定度u1（C）

由天平检定证书得到天平重复性误差为0.1mg，服从矩形分布，k=，转化为标准不确定度u1（C）==0.577×10-4（g）。

3.5.2.2 天平校准引入的不确定度u2（C）

由天平说明书得到电子天平线性误差为±0.2mg，服从矩形分布，k=，转化为标准不确定度u2（C）==0.115×10-3（g）。

准确称取多菌灵标准物质0.010 0 g，综上得到标准物质称量引入的相对标准不确定度u2rel（C）==0.012 9。

3.5.3 标准溶液配制过程中量器校准引入的不确定度u3rel（C）

标准储备溶液配制过程：将称量好的0.010 0 g多菌灵标准物质用甲醇溶解定容到100mL，配制成浓度为100μg/m L的标准储备溶液。用1m L的可调移液器吸取1mL 100μg/mL的标准储备溶液，用甲醇溶解定容到100mL，配制成浓度为1μg/mL的标准储备溶液。

标准工作溶液配制过程：分别准确量取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL浓度为1μg/mL的标准储备溶液，用流动相分别定容到10mL，配制成浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32μg/m L的标准工作溶液。

标准溶液制备过程中使用检定合格的玻璃量器10、100mL容量瓶，5、2、1mL刻度移液管，10μL～1 000μL移液器，按照《常用玻璃量具检定规程JJG 196-2006》和《移液器检定规程JJG 646-2006》的要求，均有相应的容量允差，按照矩形分布考虑，k=，即标准不确定度=，由此可得到量器校准引入的相对标准不确定度分量见表1。

由表1可得，标准溶液配制过程中量器校准引入的合成相对标准不确定度为：

表1 标准溶液配制过程量器校准引入的不确定度Table 1 Uncer tainty arouse from errors in calibration of volum etric glasswaresused in p reparations of standard solutions

3.5.4 标准溶液配制过程中环境温度变化引入的不确定度u4rel（C）

实验过程中，实验室的温度很难保证在20℃，温度变化引起的液体膨胀明显大于量器的体积膨胀，因此，只考虑前者即可。已知水的体积膨胀系数为2.1× 10-4/℃，当配制溶液时室温在（20±3）℃之间波动时，产生的体积变化计算公式为：±（量取体积×3×2.1× 10-4）mL。按照矩形分布考虑，k=，则标准溶液配制过程中环境温度变化产生的不确定度见表2。

由表2可得，标准溶液配制过程中温度变化引入的合成相对标准不确定度为：

3.5.5 校准曲线拟合引入的不确定度u5rel（C）

多菌灵标准工作溶液配制5个浓度梯度，每个浓度梯度用高效液相色谱测定3次，得到相应的峰面积，如表3所示。

用最小二乘法进行拟合，得到直线方程yij=bCi+ a（其中，a=0.043 1，b=92.88），相关系数R=0.999 8。式中，yij为第i个标准溶液第j次峰面积；Ci为第i个标准溶液浓度；b为斜率；a为截距。

表2 标准溶液配制过程环境温度变化引起的不确定度Tab le2 Uncertainty arouse from effect change in tem peratureon thevolumetric glasswaresduring preparationsof standard solutions

表3 标准溶液测定结果Table3 Resultsof standard solutions

对样品处理液进行2次测定，由测得的峰面积通过校准曲线求得两次测定结果，分别为0.045 0、0.0470μg/mL，则C0=（0.045 0+0.047 0）/2=0.046 0μg/mL，则标准曲线拟合的标准不确定度为：

式中：C0为由标准曲线计算出样品中多菌灵的浓度为标准样品的平均浓度（=0.124μg/mL）；p为样品溶液测定的次数，p=2；n为工作曲线测定的点数，n=15；为第i个标准溶液的浓度，μg/mL；b为拟合曲线的斜率；s（y）为拟合曲线的标准偏差。

拟合曲线的标准偏差

综上得到标准溶液中多菌灵的浓度引入的相对标准不确定度为：

3.6 标准工作溶液峰面积测量引入的不确定度urel（AS）

3.6.1 峰面积重复测量引入的不确定度u1（As）

将0.040μg/m L标准溶液重复进样6次，得到多菌灵的峰面积分别为4.023、4.028、4.020、4.017、4.027、4.020，其平均值AS=4.022，平均值的测量标准偏差=0.001 78，转化为相对标准不确定度为

3.6.2 仪器校准引入的不确定度u2（As）

由仪器检定证书得到仪器定量重复性误差为1.4%，按照矩形分布考虑，k=，所以相对标准不确定度为：u2rel（AS）==0.008 08

综上得到标准工作溶液峰面积测量引入的相对标准不确定度为：0.008 09。

3.7 样品中多菌灵峰面积测量引入的不确定度urel（A）

3.7.1 峰面积重复测量引入的不确定度u1（A）

将样品处理液重复进样6次，得到多菌灵的峰面积分别为4.233、4.241、4.220、4.230、4.227、4.238，其平均值=4.232，平均值测量的标准偏差=0.003 11，转化为相对标准不确定度为

3.7.2 仪器校准引入的不确定度u2（A）

同3.6.2，得到仪器校准引入的相对标准不确定度为：u2rel（As）=0.008 08。

综上得到样品中多菌灵峰面积测量引入的相对标准不确定度为：urel（A）==0.00811。

3.8 回收率引入的不确定度urel（frec）

样品前处理过程包括提取和净化等步骤，过程复杂，样品处理操作过程中的差异引起的不确定度实验中以6次回收率的结果统一评定。在阴性样品基质中添加浓度为0.040mg/kg的多菌灵标准溶液，6次回收率测定结果为：91.3%、90.6%、94.3%、95.2%、90.0%、93.1%，平均值=92.4%，标准偏差为S（frec）=2.10%，回收率的标准不确定度为u（frec）==0.857%，回收率的相对标准不确定度为urel（frec）==0.009 28。

3.9 测量重复性产生的A类不确定度urel（w）

对同一样品进行连续6次测试，数据见表4。

表4 多菌灵含量重复性测定结果Table 4 Resultsof carbendazim of repeat determ ination

单次测定标准偏差s（wi）== 0.000 871mg/kg，平均值的标准偏差u（w）== 0.000 356mg/kg，相对标准不确定度urel（w）== 0.007 84。

4 合成相对标准不确定度

5 扩展不确定度

取包含因子k=2，置信水平约为95%，w= 0.045 4mg/kg，扩展不确定度U（X）=k×urel（X）×0.0454= 0.004 38mg/kg。

6 测量不确定度报告

样品中多菌灵含量的不确定度报告如下：X=（0.045±0.004 4）mg/kg，k=2。

7 结论

从上述不确定度整个评定过程可以看出，影响最终不确定度结果的主要是标准溶液的配制、样品回收率两个分量，而样品称量和定容过程对最终不确定度结果影响较小。因此，在检测过程中应严格控制测量和样品处理过程，特别应强调检测过程准确性和前处理操作过程的规范性，以及标准工作溶液配制的精确性，认真对待每个环节确保检测结果的准确可靠。

[1]国家质量技术监督局.JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S].北京:国家质量监督检验检疫总局,2012

[2]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL06:2011化学分析中不确定度的评估指南[S].北京:中国知识出版社,2011

[3]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL01:2006检测和校准实验室能力认可准则[S].北京:中国知识出版社,2006

[4]杨楠,张琦,权伍英,等.QuEChERS前处理方法结合液相色谱-串联质谱技术检测蔬菜中的多菌灵[J].中国卫生检验杂志,2011,21 (5):1096-1097

[5]杨媛,石磊,李文生,等.高效液相色谱法测定苹果中多菌灵残留量的测量不确定度分析[J].农药学学报,2010,12(3):349-354

Uncertainty Evaluation for the Determ ination Resu lts of Carbendazim in Concentrated Fruit Juice by HPLC

LIU Sheng-nan，GONGWei-dong，ZHANGGuo-qing，WEIXing，SHUAIJin
（Sanmenxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.China，Sanmenxia472000，Henan，China）

Based on SN/T 1753-2006，amathernaticalmodel of uncertainty evaluation for the determinationresultsof carbendazim in concentrated fruit juice by HPLCwasestablished.The sources of uncertainty for the whole determination procedure were analyzed and the combined uncertainty was then finally obtained by synthesizing the variousmeasurementofuncertainty.The resultshowed the expanded uncertainty of0.004 4mg/ kg（k=2）with 0.045 mg/kg of the content of carbendazim was derived.Themajor sources of uncertainty of measurement included preparationsofstandard solutions，sampleprocessing.Thispaper provided reliable basis to controlanalysisqualityof carbendazim detection in concentrated fruit juice.

uncertainty；carbendazim；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）；concentrated fruit juice

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.024

2013-12-22

刘胜男（1987—），女（汉），硕士研究生，主要从事进出口食品检测。