张居作，许巧玲，徐君飞，*

（1.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，怀化学院生命科学系，湖南怀化418008；2.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

苦瓜多糖含量的苯酚硫酸法检测研究

张居作1，2，许巧玲1，徐君飞1，*

（1.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，怀化学院生命科学系，湖南怀化418008；2.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

为了寻找适于测定苦瓜多糖含量的稳定方法，本文对苯酚硫酸法测定苦瓜多糖的条件进行了研究。实验结果表明，在苯酚硫酸法中，测定条件为1mL 1%苦瓜多糖溶液与0.4m L 6%苯酚、4.5mL浓硫酸60℃显色10min，493 nm波长处测定吸光度。结果表明，改进后的苯酚硫酸法是测定苦瓜多糖含量的一种回收率高，稳定性好的简便方法。

苦瓜多糖；苯酚-硫酸法；检测

苦瓜多糖是苦瓜的主要有效成分[1]，经研究表明，苦瓜多糖具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病、提高免疫力等功效[2]，为了便于苦瓜种植基地和加工企业控制、检测苦瓜原料的质量，进而控制和确保苦瓜制品的质量，有必要建立一套操作简单、容易实施的苦瓜多糖测定方法。

目前测量多糖含量的方法主要是苯酚—硫酸法[3-4]，但是，苯酚—硫酸法测定多糖含量仍然存在着数据波动较大，重复性差等缺点，为了提高测定方法的准确性和重复性，本文通过一系列实验确定了苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖的最佳条件，使得改进后的苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量的数据更可靠、更稳定。

1 材料与方法

1.1 材料

苦瓜，购自菜市场；D-葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇等均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；P05-Y纯水仪，国之源有限公司；5804R高速冷冻离心机，Eppendorf；UV-2450紫外可见分光光度计，岛津公司；R201D旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂，等。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

苦瓜切片干燥粉碎→过40目筛→80%乙醇90℃回流提取2次→滤渣60℃烘干。

1.2.2 苦瓜多糖提取

称取预处理苦瓜粉→1∶50加入超纯水96℃浸提230min→6 000 r/min离心10min取上清→60℃旋转蒸发浓缩至原滤液体积1/5→加5倍体积85%乙醇→冰箱放置过夜→6 000 r/min离心10min取沉淀→60℃干燥至恒重。

1.2.3 苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量条件的优化

1.2.3.1 最大吸收波长

分别吸取苦瓜粗多糖溶液和60.0μg/mL葡萄糖标准溶液各1mL于具塞比色试管，加水补足至2mL，以蒸馏水为空白，加入1m L 6%苯酚溶液，摇匀后迅速滴加5mL浓硫酸，室温反应30min，采用紫外可见分光光度计在400 nm～600 nm进行波谱扫描，确定最大吸收波长。

1.2.3.2 最适浓硫酸用量

吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水补足至2mL，加入1m L 6%苯酚溶液，摇匀，分别迅速滴加3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL浓硫酸[5]，室温放置30min，于最大吸收波长处测定吸光度，选择浓硫酸的最适用量。

1.2.3.3 最适苯酚用量

吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水补足至2mL，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L 6%苯酚溶液[6]，摇匀，迅速滴加4.5mL浓硫酸，室温放置30min，测定吸光度，选择苯酚的最适用量。

1.2.3.4 最适显色温度

吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水补足至2mL，加入0.4mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速滴加4.5mL浓硫酸，摇匀，分别在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃下放置30min，测定吸光度，选择最适显色温度。

1.2.3.5 最适显色时间

吸取1m L苦瓜粗多糖溶液，加水补足至2mL，加入0.4mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速滴加4.5mL浓硫酸，摇匀，60℃放置5、10、15、20、25min，测定吸光度，选择最适显色时间。

1.2.3.6 葡萄糖标准曲线的绘制

准确吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL，加水补足至2mL，制成浓度分别为12、36、60、84、108μg/mL的葡萄糖溶液，加入0.4mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速滴加4.5m L浓硫酸，60℃水浴10min，于493 nm测定吸光度，以标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

1.2.3.7 苦瓜多糖含量的测定

准确吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水补足至2mL，加入0.4mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速滴加4.5mL浓硫酸，60℃水浴10min，于493 nm测定吸光度，根据葡

式中：n为稀释倍数；X为葡萄糖质量浓度，（μg/mL）；V为样品液的体积，mL；m为预处理后粗多糖质量，g。1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度实验

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL，按照标准曲线制备方法测定吸光度，平行测定5次，比较5组结果，分析苯酚—硫酸法测苦瓜多糖含量的精密度[7]。

1.2.4.2 稳定性实验

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL，按照标准曲线制备方法，每隔0.5 h记录一次吸光度，连续记录3h，比较6组结果，分析苯酚—硫酸法测苦瓜多糖含量的稳定性[8]。

1.2.4.3 加样回收率实验

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL 5份（试样），各加入葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L（加标试样），按照标准曲线制备方法测定吸光度，再根据标准曲线方程计算加样回收率。计算公式为：回收率/%=[100（加标试样测定值-试样测定值）/加标量]%[9]。萄糖标准曲线计算苦瓜多糖浓度，再根据下述公式计算苦瓜多糖的提取率。

计算公式为：（赵宁等，2011）

2 结果与分析

2.1 苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量条件的优化

2.1.1 最大吸收波长

葡萄糖标准溶液和苦瓜多糖样品溶液在400 nm～600 nm波谱扫描结果显示，葡萄糖标准溶液在484 nm处有最大吸收，苦瓜多糖样品溶液在493 nm处有最大吸收，后者更适合苯酚—硫酸法反应体系，因此本实验中选择493 nm为测定波长。

2.1.2 最适浓硫酸用量

浓硫酸用量对苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量影响如表1所示。

表1 浓硫酸用量对吸光度值的影响Table1 The in fluence of dosage of sulfuric acid on absorbancevalue

由表1可知，浓硫酸用量在3.0mL～4.5mL范围内，OD493随浓硫酸用量增加而增加，在4.5mL时，OD493增加至最大值，5.0mL后OD493开始减小。这可能是因为随着浓硫酸用量的增加，苦瓜多糖逐渐被碳化，不能水解成游离单糖，与苯酚反应生成橙黄色化合物。因此，苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量时，硫酸的添加量是测定结果稳定性的一个重要影响因素，添加量过小或过大，显色反应皆不均匀。由上述数据可知，最适浓硫酸用量选择4.5m L。

2.1.3 最适苯酚用量

苯酚用量对苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量影响如表2所示。

表2 苯酚用量对吸光度值的影响Table2 The influence ofdosageof phenolon absorbancevalue

由表2可知，苯酚用量在0.2mL～0.4mL，OD493随苯酚用量增加而增加，在0.4mL时，OD493增加至最大值，0.4mL后OD493开始减小。这可能是因为苯酚用量增加，浓硫酸先与苯酚反应，与苦瓜多糖反应量相应减少，因此苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量的最适苯酚用量选择0.4m L。

2.1.4 显色温度

显色温度对苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量影响如表3所示。

表3 显色温度对吸光度值的影响Table 3 The influenceof developing tem peratureon absorbancevalue

由表3可知，显色温度在20℃～80℃范围内，OD493随显色温度增加而增加，60、70、80℃处的OD493值相对恒定，80℃后OD493开始减小。这是因为显色温度升高到苦瓜多糖保护温度60℃及以上，苦瓜多糖活性结构遭到破坏，不能与苯酚反应生成橙黄色化合物。因此，苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量的最适显色温度选择60℃。

2.1.5 显色时间

显色时间对苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量影响如表4所示。

表4 显色时间对吸光度值的影响Table4 The influenceofdeveloping timeon absorbancevalue

由表4可知，显色时间在5min～10min范围内，OD493随显色时间延长而增加，在10min时，OD493增加至最大值，10min后OD493开始减小。这是因为随着显色时间的延长，苯酚稳定性降低，苦瓜多糖与之反应量减少。因此，苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量的最适显色时间选择10min较好。

2.1.6 葡萄糖标准曲线制作

根据葡萄糖质量浓度和所测得的吸光度数据，以标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线方程为：y=0.008 9x+0.005 0（其中y吸光度，x葡萄糖浓度），线性相关系数R2=0.999 8，标准品在0～100μg/mL范围内呈良好的线性关系，可较精确计算出苦瓜多糖含量。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度实验

精密吸取苦瓜粗多糖溶1mL，按照标准曲线制备方法测定吸光度，平行测定5次，计算相对标准偏差RSD值，实验结果如表5所示。

表5 精密度实验Table5 Precision of themeasured results

结果表明相对标准偏差RSD为1.312%＜2%，说明此测定方法精密度良好。

2.2.2 稳定性实验

精密吸取苦瓜粗多糖溶1mL，按照标准曲线制备方法测定吸光度，连续3 h内检测其稳定性，结果如表6所示。

表6 稳定性实验Table6 Reproducibility of themeasured results

结果表明样品的吸光度在3 h内基本不变，相对标准偏差RSD=1.134%＜2%，显色稳定，说明此测定方法稳定性较好。

2.2.3 加样回收率实验

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL 5份（试样），各加入葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L（加标试样），按照标准曲线制备方法测定吸光度，再根据标准曲线方程计算加样回收率。结果如表7所示。

表7 回收率实验Table7 Recoveriesof themeasured results

由表7可知，采用苯酚—硫酸法测定苦瓜中多糖含量的加样回收率较高，均值为98.69%，相对标准偏差RSD为2.04%＜3%，因此该方法准确度较高。

3 结论

以葡萄糖为标准品，苯酚—硫酸法测定苦瓜多糖含量的最佳条件为：最大吸收波长493 nm、6%苯酚0.4mL、浓硫酸4.5mL、显色温度60℃，显色时间10 min，该方法平均回收率为98.69%，RSD为2.04%（n=5），样品液在3 h内显色稳定，操作简单，条件易控制，重现性较好，对苦瓜中多糖含量的测定可获得满意的结果，既可用于固体样品的多糖含量测定，亦可用于液体样品的测定，是一种适用性广，回收率高，稳定性好的苦瓜多糖含量的测定方法[10-11]。

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Determ ination of M omordica Charantia Polysaccharide by Imp roved Phenol-su lfuric Acid Method

ZHANG Ju-zuo1，2，XUQiao-ling1，XU Jun-fei1，*
（1.Key LaboratoryofHunan Province forStudyand Utilization of Ethnic MedicinalPlantResources，Departmentof Life Science，HuaihuaUniversity，Huaihua 418008，Hunan，China；2.Veterinary Faculty，Hunan AgriculturalUniversity，Changsha 410128，Hunan，China）

The conditions for determinating momordica charantia polysaccharide by phenol-sulfuric acid method was studied.The results showed the optimum determinating conditionswere 1mL 1%polysaccharide solution and 0.4mL 6%phenol，4.5mL sulfuric acid color 10min at60℃，mensurating absorbance by using spectrophotometer at 493 nm.These procedures improved stability and repeatability of phenol-sulfuric acid method andwereeasy tooperate.

momordica charantiapolysaccharide；phenol-sulfuric acidmethod；determinate

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.021

2014-10-11

湖南省科技厅项目（2013NK4109）；湖南省重点学科建设项目资助（2011-42）；民族药用植物活性成分高效利用湖南省高校创新团队经费资助（2010-53）

张居作（1981—），男（汉），硕士研究生，主要从事生物学研究。

*通信作者：徐君飞（1981—），女（汉），博士研究生，主要从事农产品加工研究。