朱俊丰， 桑力轩， 杨芳丽， 李 岩， 翟景波， 高植鹏，邓芳博， 孙 逊， 王大南， 吕昌龙*

(1.中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036)



小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

朱俊丰1,2， 桑力轩1， 杨芳丽1， 李 岩1， 翟景波1， 高植鹏1，邓芳博2， 孙 逊1， 王大南1， 吕昌龙1*

(1.中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036)

克隆小鼠 IL-33基因构建其真核表达质粒，并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA，经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增小鼠 IL-33基因，酶切后插入pcDNATM3.1/myc-HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33，重组质粒转染COS-7细胞，RT-PCR和免疫印迹法(western blotting)检测目的基因表达。结果显示，pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致，重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA，并构建其真核表达质粒。

白细胞介素33；基因克隆；表达质粒构建；真核表达

白细胞介素-33(IL-33)是2005年发现的细胞因子，为IL-1类细胞因子超家族成员，广泛存在于多种组织细胞中，是炎症反应的重要调节因子之一[1-2]。目前认为IL-33具有双重生物学功能，即在正常状态下存在于细胞核中，作为转录抑制因子发挥作用[3]；细胞损伤时释放到胞外成为一种免疫系统的危险信号，与受体ST2结合，作为细胞因子发挥免疫调节作用[4]。小鼠的IL-33 cDNA编码266个氨基酸, 其相应全长蛋白质的相对分子质量为30 kD[5]。有研究表明全长IL-33是参与机体活动的有效形式，剪切后的可溶性IL-33活性下降，主要在血清中出现，可能成为一种疾病标记物[6]。但是另有研究发现，全长 IL-33经过中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶G剪切能够产生生物活性10倍于全长 IL-33的片段[7]。综上所述，IL-33的活性形式依然存在争议。为了进一步研究IL-33活性，本文利用基因工程的方法在大肠埃希菌中高效表达出鼠IL-33成熟蛋白，并对免疫学活性进行了初步研究, 为深入研究IL-33的免疫学作用及其分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、菌株与质粒 C57BL/6小鼠购自中国医科大学实验动物中心；大肠埃希菌E.coli-DH5、COS-7细胞、表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA由本室保存。

1.1.2 试剂 RNAiso Plus、载体连接试剂盒、限制性核酸内切酶、PCR试剂、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自北京原平皓公司，Trizol、EasyScriptcDNA第一链合成试剂盒为全式金公司产品，lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司，DMEM培养基、新生小牛血清、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂购自汇百生物公司。抗Myc的单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司。其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank小鼠IL-33序列和pcDNA3.1/myc-HisA载体特性, 按照酶切位点对侧翼序列的要求设计引物并包含相应的酶切位点 (引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。IL-33上游引物: AGCAAGCTTGCCACCATGAGACCTAGAATGAAGTAT，含酶切位点HindⅢ；下游引物: AGCTCTAGAGATTTTCGAGA-

GCTTAAAC，含酶切位点XbaⅠ，不含终止密码子。上游引物中含有Kozak序列。同时，调整下游引物使IL-33能融合表达Myc和HisA标签。

1.2.2 RNA 的提取及RT-PCR 用RNAiso Plus提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA，按全式金公司提供的cDNA第一链合成说明进行反应获得cDNA，随即进行聚合酶链反应(PCR)获得IL-33基因编码序列，反应条件: 95 ℃ 5 min，进入循环，94 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。产物经1%溴化乙锭-琼脂糖凝胶电泳分离分析PCR产物，用DNA回收纯化试剂盒回收扩增的目的基因。

1.2.3 IL-33cDNA的克隆及测序 将上述回收片段经HindⅢ与XbaⅠ双酶切，插入上述酶酶切线性化的pcDNATM3.1/myc-HisA载体，连接后转化DH5α感受态菌，过夜培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒 DNA 进行酶切鉴定, 命名为 pcDNA3.1-IL-33。送南京金斯瑞生物公司进行插入片段序列测定。

1.2.4 重组质粒的细胞转染与表达 对数生长期COS-7细胞培养于含血清及双抗的DMEM培养液中，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，将3×105个细胞/孔接种于6孔板，每孔DMED培养基定容至3 mL，培养24 h后，采用lipofectamine2000转染试剂按试剂说明转染pcDNA3.1-IL-33与空载体，并设空白对照，10 h后弃去转染液，换新鲜培养基继续培养，转染后24 h分别收集实验孔及空载体对照孔、空白对照孔的细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测细胞IL-33基因表达；于转染后不同时间用冰冷细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解产物，Western blot法检测培养细胞IL-33表达，检测方法按试剂说明进行。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增小鼠IL-33基因

分离小鼠肺组织总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下可见3条清晰条带，分别为28S RNA、18S RNA和5S RNA(图1A), 28S RNA与18S RNA无弥散现象，说明RNA未被降解。总RNA经逆转录为cDNA后进行PCR反应, 将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳可见一亮带，大小约801 bp，与IL-33基因片断预期大小相符(图1B)。

2.2 pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒的构建

HindⅢ与XbaⅠ双酶切后的小鼠肺组织IL-33的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳回收，与上述酶酶切后的pcDNA3.1/myc-HisA进行定向连接，连接后转化DH5α感受态菌。抽提质粒，行HindⅢ与XbaⅠ双酶切鉴定，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符(图2)。南京金斯瑞生物科技有限公司DNA测序结果与IL-33cDNA序列一致。

图1 小鼠IL-33基因扩增结果Fig.1 RT-PCR of IL-33A：Tranzol提取小鼠肺总RNA，M：DL2 000 DNA Marker；1：小鼠肺组织总RNA；2：小鼠肺组织IL-33PCR产物；B：RT-PCR扩增小鼠IL-33，M：DL2 000 DNA MarkerA：Total RNA was extracted from mouse lung using Tanszol. M：DL2 000 DNA Marker；1：Total RNA of mice lung； B：Amplify mouse IL-33 cDNA by RT-PCR. M：DL2 000 DNA Marker；2：PCR products of IL-33

图2 pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒酶切鉴定结果Fig.2 Identification of recombinant plasmidpcDNA3.1-IL-33 byenzyme digestionM：DL2000 DNA Marker；1：pcDNA3.1-IL-33双酶切；2：pcDNA3.1-IL-33；M′:λ-HindⅢ digest DNA MarkerM：DL2000 DNA Marker；1：pcDNA3.1-IL-33digested with HindⅢand XbaⅠ；2：pcDNA3.1-IL-33；M′:λ-HindⅢ digest DNA Marker

2.3 重组质粒在COS-7细胞中的表达

分别收集空白对照、pcDNA3.1-IL-33与空载体转染的COS-7细胞，逆转录获得cDNA模板进行PCR扩增。结果表明, 从重组质粒转染的COS-7细胞中可扩增出IL-33基因, 而空质粒转染和未转染细胞中未扩增出目的条带(图3A)，Western blot法证实pcDNA3.1-IL-33转染细胞48 h后的细胞裂解产物可检测到IL-33，而空载体转染细胞和未转染细胞未检测到其表达(图3B)。

图3 重组质粒在COS-7细胞中的表达结果Fig.3 Western blot and RT-PCR analysis of IL-33 prokaryotic expressionA：RT-PCR检测重组质粒在COS-7细胞中的表达，M：DL2000 DNA Marker；1：空载体转染引物扩增；2：pcDNA3.1-IL-33转染引物扩增；3：空白对照引物扩增；B：Western blot检测重组质粒在COS-7细胞中的表达，1：未转染细胞；2：pcDNA3.1-IL-33转染细胞；3：空载体转染细胞A： RT-PCR analysis of IL-33 prokaryotic expression，M：DL2000 DNA Marker；1：COS-7 cell transfected by pcDNATM3.1/myc-HisA；2：COS-7 cell transfected bypcDNA3.1-IL-33；3：COS-7 cell；B:Western blot analysis of IL-33 prokaryotic expression，1：COS-7 cell；2：COS-7 cell transfected bypcDNA3.1-IL-33；3：COS-7 cell transfected bypcDNATM3.1/myc-HisA

3 讨 论

IL-33作为新近发现的一种细胞因子和核因子，在炎症性肠病中扮演重要角色[8]。有研究认为IL-33具有“警报素”作用，当各种原因导致肠上皮细胞破坏时，IL-33作为一种危险信号从细胞中释放，激活肥大细胞和嗜碱、嗜酸性粒细胞等，促进多种炎症细胞因子的产生，并促进初始性T细胞向Th2细胞分化，趋化Th2细胞到达病灶，发挥促炎作用[9-11]。同时，还有研究发现IL -33能使炎症性肠病动物模型炎症程度减轻，症状改善，说明IL-33能抑制炎症进展[12-14]。总之，目前研究表明IL-33在炎症性肠病发病中可能具有双重作用，其参与炎症性肠病炎症进展的具体作用机制仍未完全清楚，且需进一步发掘并探索IL-33是否具有治疗价值。

本研究选择真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA，成功构建了pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒，通过体外转染细胞，转染后的细胞能够成功表达带Myc、 His 标签的小鼠IL-33全长蛋白。下一步可以通过 6×His标签对IL-33融合蛋白进行纯化，通过pull-down实验研究筛选IL-33相互作用蛋白。此外，Myc标签还可以用于免疫共沉淀和免疫印迹实验，为研究IL-33蛋白在体内的作用及信号通路提供了有力的工具[15]。

虽然本研究已经成功构建全长IL-33的真核表达质粒，但由于不同大小IL-33的活性及作用一直存在争议，需要进一步克隆不同大小的IL-33序列并构建其真核表达质粒，为进一步研究IL-33的功能和活性提供工具。

综上所述，本研究成功构建了带His、Myc双标签的pcDNA3.1-IL-33真核表达质粒，将其转染到COS-7细胞并在体外成功表达了带HisA和Myc双标签的小鼠IL-33全长蛋白，为下一步研究IL-33在炎症性肠病的作用及其分子机制奠定了基础。

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Construction & Expression of Eukaryotic Expression Plasmid of Mouse IL-33

ZHU Jun-feng1,2, SANG Li-xuan1, YANG Fang-li1, LI Yan1, ZHAI Jing-bo1, GAO Zhi-peng1,DENG Fang-bo2, SUN Xun1, WANG Da-nan1, Lü Chang-long1

(1.Teach. &Res.Div.ofImmunol.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122; 2.Schl.ofLifeSci.,LiaoningUni.,Shenyang110036)

Mouse IL-33 cDNA was cloned and constructed its eukaryotic expression plasmids and transfected into COS-7 cells to determine its expression. Total RNA of the lung of C57BL/6 mouse was extracted and amplified mouse IL-33 cDNA by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Then the resulting gene fragment was inserted into pcDNATM3.1/myc-HisA vector after digested by restriction enzyme to construct eukaryotic expression plasmid pcDNA-3.1-IL-33. The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. The expression of target gene was detected by RT-PCR and Western blotting. The inserted DNA sequence in pcDNA3.1-IL-33 was identical to mouse IL-33 cDNA, which was verified correctly by sequencing. The corresponding gene expression was detected in the recombinant plasmid-transfected COS-7 cells. The mouse IL-33 cDNA was successfully cloned and its eukaryotic expression plasmid was constructed.

IL-33; gene cloning; construction of expression plasmid; eukaryotic expression

辽宁省科学计划项目(2011415052-1)

朱俊丰 男，实验师，博士研究生。研究方向为黏膜免疫。Tel: 024-62202232，E-mail: zhujunfeng@lnu.edu.cn

* 通讯作者。教授，博士生导师。研究方向为黏膜免疫。Tel: 024-23256666-5345，E-mail: cllu@mail.cmu.edu.cn

2015-04-09；

2015-05-16

Q93-31

A

1005-7021(2015)06-0060-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.011