周 伟， 郑 维， 陶思美， 权春善， 范圣第

( 大连民族大学 生命科学学院 国家民委教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)



芽胞杆菌产生的环脂肽类物质的研究进展

周 伟， 郑 维， 陶思美， 权春善*， 范圣第

( 大连民族大学 生命科学学院 国家民委教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)

环脂肽类物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性，其潜在的应用价值已逐渐引起了人们的注意。主要针对芽胞杆菌产生的环脂肽，综述了环脂肽类物质的结构及分类、生理活性、生物合成机制。由于环脂肽结构的不同，分离纯化及鉴定方法也会有所差异，因此对环脂肽的分离纯化及鉴定方法方面也做了简单的综述。最后展望了我国对于环脂肽研究的不足及未来的发展前景。

枯草芽胞杆菌；环脂肽；化学结构；生物活性；生物合成

芽胞杆菌是一类能够产耐热、抗逆芽胞的革兰阳性菌，能够分泌多种抗菌活性物质。这些活性物质除了少数例外，大多都属于单一的多肽类群。这些多肽类物质的产生途径有两种，一种是通过非核糖体途径合成，一种是通过核糖体途径合成[1]。通过非核糖体途径合成的多肽类物质，大多数属于由肽环和脂肪酸链组成的环脂肽类物质。这类物质分子量低，主要作为微生物的次级代谢产物排出菌体体外，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物学功能[1]。自2003年 9月达托霉素首次在美国上市以来，由于其能用于治疗由革兰阳性菌感染所致的并发性皮肤及皮肤结构感染(包括对万古霉素抗性的粪肠球菌(VRE)及对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等)[2]，使得化学结构新颖、作用机制独特的环脂肽类抗生素逐渐受到关注。随着环脂肽相关研究的不断开展，为了更好地了解芽胞杆菌环脂肽的相关信息，本文对芽胞杆菌产生的环脂肽类物质的结构与分类、生物活性、生物合成及分离纯化与鉴定方法方面展开综述，旨在使初步接触环脂肽研究的工作者能快速了解到环脂肽的相关信息。

1 结构与分类

芽胞杆菌环脂肽类物质，按其结构特点可分成两类：第一类为脂肪酸链直接参与成环，即脂肪酸链上的羧基与肽链氨基酸的N-端相连，肽链氨基酸的C-端羧基与脂肪酸的β2OH或β2NH2连接成环，例如图1中表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、杆菌抗霉素(bacillomycin)、bacillopeptin，具有7个LDDLLDL手性强极性的氨基酸短肽的N端氨基，通过形成肽键与长度一般为14～17的脂肪酸链羧基相连。第二类为脂肪酸链不参与成环的环状脂肽类，即为脂肪酸链通过自身的羧基与肽链上的氨基酸的N2端形成酰胺键而连接在肽链结构上。例如图1中的丰原素类群(fengycin)和制磷脂素(plipastatin)，由8个氨基酸成环，长度一般为14～18的脂肪酸链通过自身的羧基与肽链上的氨基酸的N2端形成酰胺键而连接在肽链上，线状部分包括2个氨基酸和1个脂肪酸链。

图1 环脂肽类物质结构Fig.1 The structure of cyclic lipopeptides

2 生理活性

环脂肽类物质由于其结构的特点(由脂肪酸链和肽链组成的两性分子)，使得其本身具有稳定的理化性质。这类物质由于结构和组分上的多样性，因此具有多种生物活性，例如：抗真菌、抗炎、抗肿瘤、抗支原体等活性[3-6]。

2.1 抗菌活性

目前的研究成果表明，环脂肽通过与生物膜中的磷脂双分子层相互作用，破坏了脂膜结构，形成离子通道，促使细胞内物质外流，从而导致细胞死亡，使得环脂肽能表现出强的抗菌活性[7]。

Ajesh K.等[8]在蜡状芽胞杆菌代谢物中提取了一种surfactin家族的新型环脂肽Kannurin，并发现这种新型环脂肽具有很强的抗真菌活性。Cho Kye-Man等[9]在韩国调味酱中分离出了1株新的短小芽胞杆菌HY1，这种菌株所产生的次级代谢产物，对大豆发酵食品中两种常见的污染菌株黄曲霉和寄生曲霉具有很强的抑制活性，经检测及鉴定发现，这种菌株能产生一种Iturin家族的环脂肽。Liu Rong-Feng等[10]从海洋芽胞杆菌B-9981的代谢产物中分离出了一种新的环脂肽—marinysinA，经过研究发现，这种环脂肽具有广谱的抗植物病原菌的活性。Pecci Ylenia等[11]发现1株地衣芽胞杆菌能够代谢产生fengycin家族和surfactin家族的环脂肽，这两种环脂肽对多种人类致病菌具有较强的抗性。Romano Adriana 等[12]发现解淀粉芽胞杆菌Bo5a的代谢物对黑曲霉、灰霉病原菌及尖孢镰刀菌等多种致病菌具有广谱抗性，经过检测及鉴定发现，Bo5a菌株能产生2种分别属于surfactin家族和Iturin家族的新型环脂肽。Xu Hong-Mei等[13]对解淀粉芽胞杆菌M1的代谢物进行研究发现，M1能产生一种Surfactin家族的环脂肽，这种环脂肽对弧菌属具有广谱抗性，并对海水希瓦氏菌具有抗菌活性。Song Bo等[14]从解淀粉芽胞杆菌的代谢物中分离出了一种surfactin家族的环脂肽，这种环脂肽对来自临床分离的白色念珠菌具有很强的抑制作用。

2.2 抗肿瘤活性

Kim Seo-Youn等[15]研究发现，surfactin能够通过诱导细胞凋亡以及阻断细胞周期来强烈抑制结肠癌细胞的增殖，根据DNA片段的证据表明，surfactin可能由于能抑制细胞的生存调节信号通路ERK和PI3K/Akt，进而诱导细胞凋亡，抑制结肠癌细胞的增殖，表现出抗肿瘤活性。

Hajare SN等[16]从解淀粉芽胞杆菌菌株的次级代谢产物中分离出了一种结构上类似bacillomycin D的环脂肽，经过研究发现，这种环脂肽对A549(肺腺癌细胞)、A498(肾癌细胞)和CT-15(结肠腺癌细胞)3种癌细胞具有不同程度的杀伤作用，并呈剂量依赖的关系。流式细胞仪、烟酸己可碱33342核染色等分析结果显示，这种环脂肽能够造成癌细胞DNA的大范围损伤，癌细胞死亡的主要机制是发生细胞凋亡，并以细胞皱缩、核固缩、细胞破裂3种形式死亡。

2.3 抗炎活性

环脂肽类物质也有较强的抗炎活性。环脂肽能对一些物质具有抑制作用，从而表现出相应的生理活性，例如Kim Kwangpyo 等[17]的研究结果表明，surfactin 能够直接与细胞磷脂酶A2相互作用，这种相互作用是选择性的抑制，在炎症实验中，surfactin选择性抑制了非洲绿猴肾上皮细胞磷脂酶A2 的活性，从而进一步抑制了炎症介质花生四烯酸的释放，因此表现出抑制炎症反应的活性。

Hwang Mi-Hyun等[18]从枯草芽胞杆菌次级代谢产物中分离出了一种具有抗炎活性的环脂肽surfactin C。经过对小鼠细胞的体外实验发现，脂多糖能够诱导环氧合酶(COX)-2、白细胞介素(IL)-1β以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA转录的升高，而surfactin C则能够抑制这种脂多糖诱导的鼠源巨噬细胞NO、IL-1β以及 iNOS 转录的升高，表现出抗炎的活性。

2.4 其他活性

环脂肽除了具有抗菌、抗肿瘤、抗炎等活性外，还具有促进免疫、抗病毒等其他生理活性。

Gao Zhen-Qiu等[19]从解淀粉芽胞杆菌的次级代谢产物中分离出一种属于surfactin家族的环脂肽WH1fungin，这种环脂肽可作为引发强烈免疫反应的静脉免疫佐剂。在他们的研究中，WH1fungin首次报道作为一种口服的免疫佐剂，具有类似于CTB不引起自身免疫反应的同时，增强细胞体液免疫的作用。小鼠体外实验结果表明，WH1fungin能够作为口服免疫佐剂来增强体液免疫，其作用机理：WH1fungin不仅能在胃酸pH环境中与抗原形成共沉淀，保护蛋白抗原在酸性情况下不会水解或被胃蛋白酶降解，还能促进肠道对于OVA(卵清蛋白)的摄取。

Vollenbroich Dirk等[20]在对于surfactin抗病毒活性研究中发现，surfactin具有广谱的抗病毒活性，例如对 HSV(单纯疱疹病毒)、VSV(疱疹性口炎病毒)、EMCV(鼠脑心肌炎病毒)、SIV(猿免疫缺陷病毒)等病毒具有不同程度的灭活作用。体外实验结果表明，surfactin能够造成病毒脂膜以及衣壳的裂解，对于包膜病毒的灭活(特别是疱疹病毒和逆转录病毒)比对无包膜病毒的灭活更加有效。

3 生物合成

3.1 非核糖体肽合酶的组成

非核糖体途径合成的脂肽类物质广泛存在于细菌和真菌中[21]，这类物质是由非核糖体肽合酶(NRPSs)合成的。NRPSs具有多个结构域(图2)，它催化环脂肽生物合成中的所有必需的步骤。每个非核糖体肽合酶合成肽的过程都需要NRPSs的3个核心结构域的协同作用[22]，这3个核心结构域为识别同源氨基酸并腺苷化的腺苷化结构域(adenylation domain，550aa)、负责运载氨基酸的巯基化结构域或氨酰载体结构域(thiolation or peptidyl carrier domain，80aa)以及负责肽键形成的缩合结构域(condensation domain，450aa)，保证了肽链的合成，非核糖体途径合成的肽都要在NPRSs的C末端的硫酯酶结构域(thioesterase domain)终止肽链的合成，并将肽链从磷酸泛酰巯基(PPan)辅基上释放下来进行环化。

3.2 环脂肽的生物合成机制

由β-羟基或β-氨基脂肪酸缩合形成环脂肽广泛存在于芽胞杆菌中，脂肪酸链和肽链长度及组分不同的环脂肽之间会有显著的微观不均一性[23]。环脂肽surfactin(图2)是大家最为熟知的生物表面活性剂，它的合成是由3个NRPSs SrfA-C[24]介导的，硫酯酶/脂肪酰转移酶SrfD会促进合成过程的开始[25]。到目前为止，surfactin的排出机制尚不清楚，未发现起作用的运载体，surfactin可能是通过被动扩散的方式来穿过细胞膜的。在surfactin的生物合成调控途径中， ComX-ComP-ComA芽胞杆菌群体感应(QS)系统信号途径是最主要的调控途径，它调控细菌感受态细胞的形成、芽胞的产生、生物膜的形成以及抗生素的产生等[26-27]。ComX为信号分子(ComX还需要ComQ的作用才能成为有活性的信号分子) ，在胞外积累，当胞外介质中的ComX达到一定浓度时可激发细胞膜受体蛋白组氨酸激酶ComP的活性，ComP自磷酸化并将自身所携带的磷酸基团转移到调控因子ComA上，被磷酸化的ComA与srfA操纵子启动子相结合，进一步激活该操纵子的转录[28]。

Iturin家族的环脂肽抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、iturin和杆菌抗霉素(bacillomycin)具有强的抗真菌及溶血活性[29]，它们分别由结构类似的mycosubtilin合成酶、iturin合成酶及bacillomycin合成酶合成，这些合成酶都是由相对应的基因编码翻译(见图2)。

Fengycin兼有几种特别的结构特性：脂肪酸链不参与环化、具有羟基侧位基团，Fengycin由非核糖体合成酶(NRPSs)fengycin合成酶合成，对丝状真菌具有广谱抗性。fengycin合成酶具有5个结构域Fen1～Fen5，由相应的5个基因编码翻译(见图2)[30]。

虽然这些酶都是由相应的基因翻译合成的，但是基因组中含有编码surfactin合成酶或者fengycin合成酶的基因并不代表就能产生相对应的环脂肽。以枯草芽胞杆菌168为例，尽管芽胞杆菌168基因组中保存有编码surfactin和fengycin合成酶的基因，但是并不能合成出surfactin和fengycin。因为Surfactin的合成依赖于磷酸泛酰巯基转移酶Sfp[30]，它能激活没有活性的surfactin和fengycin合成酶。而枯草芽胞杆菌168中的sfp等位基因由于移码突变而表达出没有活性Sfp[31]，因此不能激活相应的合成酶从而合成环脂肽。这也使得近年来对沉默的肽合酶基因挖掘的研究变得更有意义，例如Kazuya Yamanaka等[32]运用TAR克隆方法直接克隆并重构了沉默的taromycin A环脂肽肽合酶基因簇，并成功表达出了具有生理活性的结构类似于达托霉素的环脂肽taromycin A。

近年来，还未见NRPSs基因体外异源表达的相关报道，其中的原因一方面是由于NRPSs基因大多都是几十kb甚至上百kb，因此对于NRPSs基因的克隆变得困难。另一方面，是由于NRPSs基因异源表达的非核糖体肽合酶可能是没有活性的蛋白，不能合成相应的环脂肽类物质。

图2 环脂肽及相关合成酶基因Fig.2 Cyclic lipopeptides and related synthetase genes

4 定性检测、分离纯化及结构鉴定

4.1 定性检测

根据环脂肽的物理化学性质，环脂肽具有以下几种定性方法：原位酸水解-茚三酮显色法、毛细管反应法、水显色法。原位酸水解-茚三酮显色法的原理是将样品先进行薄层分离后进行原位水解，再与茚三酮反应呈现黄色或者紫红色，此法可用来初步鉴定环脂肽化合物，具有灵敏度高、专一性强、重复性好的优点。毛细管反应法是将样品液和浓盐酸先后吸入毛细管中水解，水解液薄层展开后用茚三酮显色，观察水解部分与样品溶液部分的颜色变化来证明是否有环脂肽的存在。水显色法是检测环脂肽中疏水基的存在，样品薄层展开后用水显色加热后，出现白色斑点则可说明有疏水基的存在[33]。

4.2 分离纯化

环脂肽的分离纯化只要是依据其理化性质，一般都要经过沉淀、萃取、层析、高效液相色谱等一系列分离纯化步骤。沉淀多是发酵液的预处理，目的是将所要纯化的环脂肽沉淀下来，常用的沉淀法有多种，如浓盐酸沉淀法、硫酸铵沉淀法、氯化锰沉淀法等。由于环脂肽大多具有耐强酸的性质，故浓盐酸沉淀法使用最为广泛，但浓盐酸沉淀同时沉淀出了杂蛋白及色素等杂质。

沉淀后去除上清，干燥(例如冷冻干燥)沉淀，如果沉淀时使用的是浓盐酸沉淀法，在干燥沉淀前用pH 2.0的水洗沉淀2～3次，此步骤能去除较多的水溶性杂质。得到干燥后的沉淀再进行萃取，萃取的目的是将环脂肽溶解到溶剂中，从而去除不溶于溶剂的杂质，便于进一步纯化及活性检测，不同环脂肽具有不同的特性，所以萃取时也将选取不同的萃取溶剂。常用的用于环脂肽分离纯化的萃取溶剂有甲醇、乙醇、氯仿/甲醇等有机溶剂，其中甲醇使用最为广泛，因为绝大多数的环脂肽都能溶于甲醇。萃取离心去除沉淀即可获得环脂肽粗提液，粗提液中杂质含量较多且不容易去除的杂质多为色素，因此下一步层析步骤的主要目的是去除色素。

层析主要有薄层层析(TLC)、凝胶色谱层析(GPC)。层析能去除粗提液中大部分的色素等杂质，且能分离出不同类的环脂肽类物质，从而达到进一步分离纯化的目的[33]。层析后的溶液利用透析将碱性洗脱剂除去，经过冷冻干燥后获得的固体样品，再通过高效液相色谱，即可利用标样进行对比，推断出所含脂肽类物质的主要种类及相应的成分含量，从而达到对脂肽类进行定性和定量的分析。经过高效液相色谱后的环脂肽溶液可以按峰收集纯化，用来进一步进行结构分析。

4.3 结构鉴定

环脂肽结构鉴定的方法有很多，对于已经分离纯化的单一环脂肽样品可以利用MS法、2D-NMR法、氨基化学衍生法、红外光谱、核磁共振等方法进行分析。对于多种组分的环脂肽样品可以利用LC-MS、源后衰变结合机制辅助激光解吸飞行时间质谱(PSD-MALDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱等技术进行分析鉴定[33-34]。

5 展 望

芽胞杆菌产生的环脂肽类物质是由非核糖体肽合酶合成，具有多种生理活性。多重耐药性致病菌的出现，使得人们意识到了新型抗生素种类的不足。尽管目前对于环脂肽的研究很多，真正开发出来的新型抗生素产品却不多，这也使得对更多的新型环脂肽的发现及对其未知潜在的生理活性进行挖掘变得迫切。达托霉素的成功应用表明，新型环脂肽类抗生素对于治疗由多重耐药性致病菌引起的疾病或者其他人类重大疾病的治疗将会发挥着重要的作用，具有重要的应用前景。

我国对于芽胞杆菌产生的环脂肽的研究目前还存在着较多的限制因素，大多都还停留在筛选菌株与环脂肽的纯化及鉴定方面，环脂肽单一组分纯化的困难、产量低也限制了环脂肽在抗肿瘤、抗病毒等其他方面的应用研究。

尽管还存在很多的不足，但是这些问题都不能限制人们对新型环脂肽研究的热情，相信通过对新型环脂肽研究的不懈努力，在不久的将来，能够不断解决新型环脂肽应用的相关限制难题，为我国乃至全世界带来更多的新型抗生素药物。

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Advance in Cyclic Lipopeptide Substances fromBacillussubtilis

ZHOU Wei, ZHENG Wei, TAO Si-mei, QUAN Chun-shan, FAN Sheng-di

(Coll..ofLifeSci.,DalianNationalitiesUni.,KeyLab.ofMinist.ofEduc. &theStateEthnicAff.Comm.,Dalian116600)

Cyclic lipopeptide substances (CLS) have antibiotic, antitumor and antiviral activities and many other bio-activities. Their potential applications have gradually attracted people’s attention. CLS fromBacillussubtilismainly regards as the main subject in this article, their structure, classification, bio-activity and biosynthesis of CLS fromB.subtilisare basically summarized. Different structure of CLS have different methods for isolation and purification, therefore, isolation and purification of CLS are simply summarized. Finally the deficiency and development outlook to come of CLS research in China were introduced.

Bacillussubtilis; cyclic lipopeptide; chemical structure; bio-activity; biosynthesis

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC13010312，DC12010118)

周伟 男，硕士。研究方向为天然产物及药物制造技术。E-mail：137771033@qq.com

* 通讯作者。女，教授，博士。研究方向为微生物学。E-mail：mikyeken@dlnu.edu.cn

2014-10-13；

2014-11-19

Q939.93

A

1005-7021(2015)04-0080-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.014