糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达

郭彦言，王红蕾，左小明*

(长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012)

摘要[目的]使酿酒酵母高效表达糖化酵母糖化酶基因。[方法]利用PCR技术从糖化酵母中扩增出大小为2 700 bp左右的带有启动子的糖化酶基因STA1。通过限制性内切酶BspDI与Acc65I双酶切，将目的基因STA1连接到穿梭质粒pRS416中构建重组质粒pRS416-sta1，转化酿酒酵母通过筛选。[结果]糖化酶活性最高为120 U/ml，酶的最适温度为60 ℃，最适pH为5.0，在酶催化反应2 h后，酶剩余活力能达到约90%。[结论]通过基因工程手段得到高效表达糖化酶基因的酿酒酵母工程菌株。

关键词酿酒酵母；糖化酶；糖化酵母；基因表达

中图分类号S188+.4;Q786

作者简介郭彦言(1989-)，女，吉林吉林人，硕士研究生，研究方向：基因工程。*

收稿日期2015-06-15

Cloning and Expressing Glucoamylase Gene ofSaccharomycesdiastaticusinSaccharomycescerevisiae

GUO Yan-yan, WANG Hong-lei, ZUO Xiao-ming*(College of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun, Jilin 130012)

Abstract[Objective] Highly expressing glucoamylase gene of Saccharomyces diastaticus in Saccharomyces cerevisiae. [Method] The glucoamylase STA1 gene of 2700 bp with promoter from Saccharomyces diastaticus was amplified by PCR. STA1 was digested by BspDI and Acc65I with Saccharomyces cerevisiae integrative expression vectors pRS416, named pRS416-sta1. This plasmid was introduced into S.cerevisiae. [Result] The glucoamylase levels of Saccharomyces cerevisiae activity was 120 U/ml. The result of determination of enzymatic properties of glucoamylase showed that the optimum temperature of glucoamylase was 60 ℃, the optimum pH of glucoamylase was 5.0. After the enzyme reacted for 2 hours, the remaining enzyme activity achieved 90%. [Conclusion] The result indicated that the plasmid carrying extracellular glucoamylase gene could express in yeast, and this gene product could hydrolyze starch.

Key wordsSaccharomycescerevisiae; Glucoamylase;Saccharomycesdiastaticus; Gene expression

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是发酵工业的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工业[1-2]。淀粉来源广泛、成本低廉，是一种很有潜力的生物资源，工业发酵一直利用淀粉酶来分解利用淀粉。但酿酒酵母由于缺少水解淀粉的酶类不能直接利用淀粉，所以淀粉原料必须先经蒸煮、酶解或酸水解成葡萄糖后被利用[3-5]。

糖化酶主要来源于2种菌株：霉菌和酵母菌[6]。以往研究主要集中于黑曲霉或泡盛酒曲霉等霉菌中糖化酶基因的转化[7-9]。与霉菌相比糖化酵母与酿酒酵母亲缘更近，且产生的糖化酶基因遇热更不稳定，更容易在生产后对其进行灭活，对产物影响更小[10]。

采用基因工程技术，将糖化酶基因导入到酿酒酵母中，构建能产生糖化酶的酿酒酵母工程菌株，可以简化工艺步骤和设备，大大降低生产成本，具有很高的工业应用价值。由于提取的目的基因STA1自带强启动子，提高了糖化酶基因的表达率。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株和质粒。糖化酵母CICC1868购自北京北纳凯创生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α为长春工业大学生物实验室保存；酿酒酵母AH109购自普如汀生物技术(北京)有限公司；pUM-T载体购自北京百泰克生物技术有限公司；酵母表达质粒pRS416为长春工业大学生物实验室保存。

1.1.2 主要培养基。LB培养基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，pH7.0)用于培养和筛选大肠杆菌；YPD培养基(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖)用于培养糖化酵母与酿酒酵母；淀粉固体培养基(5 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，2 g/L可溶性淀粉，20 g/L琼脂，pH7.2)用于酿酒酵母阳性克隆筛选。

1.1.3 主要生化试剂。限制性内切酶BspDI与Acc65I购自上海捷瑞生物工程有限公司；RNA酶购自美国Sigma；T4DNA 连接酶购自TaKaRa公司。

1.2试验方法

1.2.1 目的基因STA1的PCR扩增。以糖化酵母全基因组为模板[11]；利用Primer Premier 5.0设计引物，上游引物5′-TACTATGGTAGGCCTCAAAAATCGAT-3′，下游引物5′-ACTTAGTTCCCCGTCTGTTCGGTACC-3′；采用Primer Star DNA聚合酶；反应条件为95 ℃ 10 min热启动；95 ℃ 30 s、45 ℃ 30、72 ℃ 1 min,35个循环；72 ℃10 min保温。

1.2.2 重组质粒pRS416-sta1构建。将pUM-T-sta1用BspDI与Acc65I双酶切，回收大小为2 700 bp的目的片段，与用同样的酶切pRS416进行连接，转化大肠杆菌进行菌落PCR和双酶切鉴定[12]，并将阳性克隆菌落质粒进行测序，与NCBI中的STA1序列进行比对。

1.2.3 酿酒酵母转化、筛选和鉴定。将重组质粒pRS416-sta1通过电转化整合到酿酒酵母菌株中[13]。将转化后的酿酒酵母接种到筛选平板培养基上，筛选阳性克隆[14]。将筛选后的阳性克隆点接于淀粉平板培养基中，采用碘熏法进行鉴定，在28 ℃培养2～3 d，用碘蒸汽熏，若在菌落周围出现透明圈则说明此菌落为糖化酶阳性菌落。

1.2.4 糖化酶酶活测定。将菌株经过诱变处理后，离心取上清液看作粗酶液。采用DNS法[15]测定粗酶液与淀粉反应30 min后产生的还原糖含量与粗酶液原有还原糖含量，两者相减得到酶液在一定时间内催化淀粉生成葡萄糖的酶量，从而计算出酶活。一个酶活力单位定义为在pH 5.0，温度60 ℃下1 min酶促反应生成1 mg还原糖含量。

1.2.5 糖化酶酶学性质的测定。分别在40、50、60、70、80 ℃下反应2 h测定原始糖化酵母和转化酿酒酵母中的糖化酶酶活，绘制最适温度曲线。分别调节粗酶液pH 2～8，使酶促反应在60 ℃不同pH中反应2 h测定原始糖化酵母和转化酿酒酵母中的糖化酶酶活，绘制最适pH曲线。在60 ℃、pH 5.0条件下分别保温20、40、60、80、120、140、160、180 min，测定不同反应时间下原始糖化酵母和转化酿酒酵母的酶活，比较2种菌株产生糖化酶的稳定性。

2 结果与分析

2.1 重组酿酒酵母表达载体构建

2.1.1目的基因连接并转化。将从糖化酵母中提取的目的基因STA1连接到pUM-T质粒中并转化大肠杆菌。筛选出阳性克隆并通过菌落PCR进行DNA电泳鉴定。当转化空质粒pUM-T时没有扩增出任何条带，而转化重组质粒pUM-T-sta1后在2 700 bp左右出现单一明亮条带，与目的基因STA1大小相符，结果见图1。

2.1.2 重组表达质粒构建。用Acc65I与BspDI双酶切重组质粒pUM-T-sta1与表达载体pRS416，分离提纯目的基因STA1并通过T4DNA连接酶与表达载体pRS416连接，构建重组质粒pRS416-sta1，结果见图2。

2.1.3重组表达质粒pRS416-sta1转化。将重组表达质粒PRS416-stal转化酿酒酵母。筛选阳性克隆并提取质粒，通过Acc65I与BspDI双酶切，DNA凝胶电泳显示在5 000 bp左右与2 700 bp左右出现亮带，与质粒大小4 898 bp，目的基因STA1大小2 700 bp大小符合，结果见图3。进一步测序表明目的基因正确导入酿酒酵母中。

2.2 酿酒酵母阳性克隆鉴定 将转化后的酿酒酵母点接于淀粉固体培养基中，28 ℃培养48 h，用碘蒸汽熏染培养基。由图4可知，转入重组质粒pRS416-sta1的酿酒酵母菌落周围出现透明圈，而转入空质粒pRS416的酿酒酵母菌落周围没有出现透明圈。说明糖化酶能在酿酒酵母中表达并分泌到胞外水解淀粉。

2.3糖化酶的SDS-PAGE检测 对转化后的酿酒酵母进行SDS-PAGE检测。目的基因STA1有效片段约为2 400 bp，理论蛋白大小为80 kD左右。SDS-PAGE检测结果表明，与转化空质粒的酿酒酵母相比，转化重组质粒pRS416-sta1的酿酒酵母在80 kD左右出现明显亮带，结果与理论蛋白大小相一致(图5)。

2.4糖化酶酶学性质 将糖化酵母和重组酿酒酵母接种于淀粉液体培养基中，28 ℃培养3 d，离心取上清液，经过透析和浓缩处理，以5%可溶性淀粉溶液为底物进行酶解反应，采用DNS法测定溶液中还原糖含量以计算酶活，并对比2种菌株中的糖化酶酶学性质。

由图6可知，重组的酿酒酵母产生的糖化酶最适温度为60 ℃，最适pH 5.0，在60 ℃、pH 5.0时酶活最高为120 U/ml左右。与原菌株产生糖化酶相比，2种菌株产生糖化酶随pH与温度变化基本相同，转化酿酒酵母后并未影响其酶的性质。

由图7可知，重组的酿酒酵母产生的糖化酶酶活随时间变化比糖化酵母的更为稳定，转化后糖化酶在120 min内酶活保持稳定，而原始菌株的糖化酶在100 min左右呈现下降趋势。

2.5重组质粒pRS416-sta1在酿酒酵母中的稳定性 将携带重组质粒pRS416-sta1的酿酒酵母在无选择压力的YPD液体培养基中多次传代培养后，取样涂平板，挑取单菌落分别点种于YPD完全培养基和含氨苄青霉素的选择培养基中，28 ℃培养2 d。能在YPD培养基中生长，不能在选择培养基中生长的即为重组质粒丢失的菌落。结果表明，在完全培养基中共生长菌落247个，选择培养基中共生长菌落224个，所以其丢失率约为9.3%，证明重组质粒pRS416-sta1在酿酒酵母中能稳定表达。

3 结论

该试验成功构建了表达糖化酵母STA1基因的酿酒酵母表达载体，筛选并获得了能稳定表达糖化酶基因的重组酿酒酵母菌株。对比糖化酵母与酿酒酵母产生的糖化酶酶学性质与稳定性，结果表明重组菌株产生糖化酶性质与原菌株基本相同，转化过程并未影响其表达产物活性，且转化后的糖化酶酶活随时间变化更加稳定，酶促反应2 h后仍有约90%酶活，且得到糖化酶的最适温度为60 ℃，最适pH为5.0，在此条件下达到最大酶活约为120 U/ml。

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