吴华俊，许 雯，林 同

(华南农业大学林学院，广东广州510642)

松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)又名松褐天牛，松天牛，属于鞘翅目(Goleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，是重要的针叶树害虫，主要危害马尾松、油松、黑松等树干和枝条的韧皮部和木质部，严重影响松树的生长.同时，也是松材线虫萎蔫病(Bursaphelenchus xylophilus)的主要传播媒介，此病是松树的毁灭性病害，已经对我国松树森林资源造成严重危害[1－2].

肌钙蛋白(Troponin，Tn)是与骨骼肌和心肌收缩有关的调节蛋白，主要调节肌肉的收缩和舒张.肌钙蛋白是横纹肌的结构蛋白，存在于肌原纤维的细丝中，由3个结构不同亚基——肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白C(TnC)组成[3－4].TnT分子质量为37 ku，可能为不对称蛋白结构，是原肌球蛋白的结合亚基[5].

由于昆虫飞行肌以很高的收缩频率运行，肌钙蛋白的激发和松弛的调节就发挥尤其重要的作用.TnT转录本与收缩性能联系紧密.Marden et al[6]研究表明，TnT转录本混合物与梅利蜻蜓(Libellula pulchella)自由飞行中的翅膀震动频率有很大的相关性.本研究从已经构建好的松墨天牛cDNA文库中筛选到TnT基因的部分cDNA序列，通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)得到了该基因的cDNA全长序列，以期为阐明松墨天牛肌肉生理学和运动性能提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

松墨天牛幼虫由广东省林科院惠赠(采自广州市萝岗区马尾松次生林).用人工饲料在25℃、相对湿度70% －75%、黑暗条件下饲养至成虫[7].

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取松墨天牛总RNA.总RNA经纯化后，用琼脂糖凝胶电泳检测其质量，并用微量紫外分光光度仪(Nanodrop 2000)检测其纯度并定量，置于－80℃保存备用.反转录反应按照PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser说明书进行，获得第一链cDNA，用于3'RACE，置于－20℃保存备用.

1.2.2 引物设计和3'RACE扩增 根据已构建的松墨天牛cDNA文库[8]，获得了肌钙蛋白的5'端序列(GenBank:JZ144485).本研究在此基础上进行3'RACE扩增，以获得肌钙蛋白基因全序列.用DNAStar中的Primer select软件设计特异性引物(Troponin Outer:AGAGGAGGAGGAAGAAGAGGAGAT;Troponin Inner:CAACGCGCAAAGGAAGAGGAAGAC)，结合试剂盒提供的2个下游引物3'RACE outer Primer(TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT)和 3'RACE inner Primer(CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG)进行巢式PCR.首先用通用引物3'RACE Outer Primer和特异性引物Troponin Outer进行第1次Outer PCR扩增，具体的PCR反应条件为:94℃预变性3 min，94℃解链30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，20个循环，72℃延伸10 min.反应完毕后取1 μL反应产物，使用通用引物3'RACE Inner PCR和特异性引物Troponin Inner进行巢式PCR的Inner PCR扩增.反应进行30个循环，其它条件同第1次Outer PCR扩增.PCR产物经由2%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA片段，与PUCm-T载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，进行AMP抗性蓝白斑筛选，挑阳性菌落提取质粒.经PCR鉴定后测序.

1.3 生物信息学分析

1.3.1 基因及蛋白质特性分析 用 NCBI在线工具 ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/gorf/grof.html)搜索开放阅读框，TMHMM分析蛋白质跨膜结构域，NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)预测磷酸化修饰位点，丹麦科技大学(DTU)的CBS服务器上的SignalP 4.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽，NetOGlye软件分析糖基化修饰，ProtScale程序分析疏水性，COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)预测卷曲螺旋，SABLE 软件(http://sable.cchmc.org/)分析二级结构，由视图工具POLYVI-EW将预测结果转化为图形形式输出.

1.3.2 构建系统发育树 通过 NCBI(http://www.Ncbi.nlm.Nih.gov/)GenBank数据库检索昆虫肌钙蛋白氨基酸序列，用DNAMAN软件对松墨天牛肌钙蛋白及其他昆虫肌钙蛋白进行同源性比对;用Clustal X软件和MEGA 4.0软件构建系统发育树(NJ法).

1.4 RT-qPCR 检测

以肌钙蛋白基因在成虫的表达量为标准参量，以微管蛋白(β-actin)基因为内参基因，无菌超纯水为阴性对照，采用RT-qPCR(SYBR Green)检测肌钙蛋白基因在幼虫、蛹、成虫各部位的表达量.所用引物为:上游:CGATGAGGAAAGGAAGATGG;下游:AAGTTGGGGCCTTTGTTCTT.RT-qPCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃解链10 s，60℃延伸20 s，进行40个循环.反应在LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行，设cDNA样品3次重复，反应结束后采集目标基因的Ct值和2个内参基因的Ct平均值，利用2－ΔΔCT相对定量法计算相对表达量.

2 结果与分析

2.1 基因克隆

将3'RACE测序结果去除载体序列部分，并与已知序列拼接获得松墨天牛肌钙蛋白基因的cDNA，命名为MaTnT(GenBank:KJ756400)，全长为1531 bp，开放阅读框(ORF)为1020 bp，编码339个氨基酸(图1)，推测的编码蛋白等电点为9.26，分子质量为37.29 ku.

图1 MaTnT基因全长及推导的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MaTnT

2.2 同源性比对及进化树构建

用DNAMAN软件做出MaTnT与嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)、果蝇(Drosophila grimshawi)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、印田鳖蝽(Lethocerus indicus)、华尺蠖(Biston betularia)、家蚕(Bombyx mori)、家白蚁(Coptotermes formosanus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、柑橘凤蝶(Papilio xuthus)、野桑蚕(Bombyx mandarina)、大红班蝶(Danaus plexippus)和点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)等12种昆虫的Tn氨基酸序列同源性比对(图2).MaTnT与图2中12种昆虫Tn同源性为87% －88%，其中与褐飞虱、黑腹果蝇、野桑蚕等10种昆虫的同源性为88%;与家白蚁、大红斑蝶的同源性为87%.

由MEGA 4.0软件构建的基于这12种昆虫Tn的系统发育树表明:松墨天牛是一个独立的分支，与家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila grimshawi)等8种昆虫遗传距离相对较近;而与家白蚁、褐飞虱、印田鳖蝽(Lethocerus indicus)、华尺蠖等(Biston betularia)4种昆虫遗传距离相对较远(图3).由于松墨天牛是鞘翅目昆虫，其他昆虫都不属于鞘翅目，这一结果与这些昆虫的传统分类地位是一致的.

2.3 跨膜结构域及翻译后修饰分析

通过MaTnT的磷酸化修饰位点预测发现，Tn分值＞0.5的磷酸化位点有:丝氨酸(Ser)磷酸化位点8个，苏氨酸(Thr)磷酸化位点9个，酪氨酸(Tyr)磷酸化位点3个，共计20个磷酸化位点，这些位点相对均匀地分布在整个多肽链中(图1).NetOGlye预测表明，MaTnT在150、161、170氨基酸位点存在N-糖基化修饰.

图2 MaTnT与其他12种昆虫Tn氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of MaTnT and Tns from other insects

2.4 MaTnT的二级结构、卷曲螺旋与疏水性分析

MaTnT二级结构为混合型，N末端和C末端区域都包含了螺旋和不规则卷曲两种形式，其中 α-螺旋占 80.53%，卷曲占 19.47%，它们构成了MaTnT蛋白的结构元件，无β-转角存在.卷曲螺旋是由2股或以上的α-螺旋相互缠绕形成的超二级结构，是控制蛋白质寡聚化的元件，也是一种简单的三级结构.MaTnT一共有14个卷曲螺旋.

在MaTnT 175－200氨基酸位存在一个明显的疏水性区域，但整个多肽链中大多数氨基酸的分值较低，亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故MaTnT属于亲水性氨基酸.

2.5 MaTnT 基因的表达

图3 基于昆虫Tn氨基酸序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of insect based on their amino acid sequences of Tn

利用RT-qPCR分析MaTnT基因在松墨天牛不同发育阶段和成虫不同部位的相对表达量，结果表明，MaTnT基因在成虫的表达量最高，在幼虫的表达量最低，蛹和幼虫的表达量分别是成虫的0.95倍和0.33倍，基因表达在三者之间差异显著(P＜0.05)(图4).MaTnT基因在成虫的头部、胸部、触角、腹部、足和触角中均有表达且有显著差异(P＜0.05)，在触角的表达量远高于其他部位，胸部的表达量最低(图5).

图4 松墨天牛不同虫态MaTnT基因表达量RT-qPCR分析Fig.4 The relative expression level of MaTnT in developmental stages of M.alternatus detected by RT-qPCR

图5 松墨天牛成虫不同部位中MaTnT基因表达量RT-qPCR分析Fig.5 The relative expression level of MaTnT in different parts of M.alternatus adults detected by RT-qPCR

3 讨论

Tn基因的数量和分布在多细胞生物中是多变的.在哺乳动物中，TnI和TnT分别由3个基因编码，并且TnT-TnI是成对组装[9－10]，然而在昆虫中，TnT基因由单个基因编码[11－12].目前对昆虫 TnT基因功能研究的不多，只有梅利蜻蜓(Libellula pulchella)TnT基因研究的报道[6].本研究克隆了松墨天牛肌钙蛋白基因，在NCBI上的Blast比对结果表明该基因是TnT基因(MaTnT)，开放阅读框为1020 bp，编码339个氨基酸，推测的分子质量为37.29 ku.

跨膜结构域是膜中蛋白和膜脂结合的主要部位，它可能定位于膜的锚定蛋白或离子通道蛋白等，也可能作为膜受体起作用.通过跨膜结构域预测可以了解蛋白质的结构、功能及在细胞中的作用部位.利用TMHMM软件对MaTnT的跨膜结构域分析，结果表明:MaTnT的整条肽链都位于膜外，不存在跨膜结构域.SignalP分析表明，MaTnT不含信号肽，说明该蛋白质属于定位在细胞质基质或细胞器基质中的蛋白质，由于不分泌到胞外，因而不属于膜蛋白或分泌蛋白，与TMHMM分析结果一致.跨膜结构主要是以α-螺旋为主，由于MaTnT不存在跨膜结构域，所以MaTnT的卷曲螺旋可能是其他功能域.

肌钙蛋白是Ca2+的受体.RNA选择性剪切产生TnT转录本的变化，从而引发梅利蜻蜓飞行肌在亚细胞和整个肌肉水平上收缩性能的变化[6].TnT的相对丰度与内肌肉纤维Ca2+的敏感性(10倍变化范围)、力量最大值(3倍变化范围)、最大功率系数正相关，也与翅膀震动频率和振幅正相关.TnT的变化可能会对这些参数产生影响，或者说TnT是显示一整套共同调控分子变化的指标.单个基因的选择性剪切可能引起更大范围内在分子、组织和整个机体水平上收缩性能的改变.TnT选择性剪切比例的变化可能是肌肉收缩性能变化的机理，因为相当少量转录本相对丰度的很小变化会引起收缩性能很大的改变[6].现在还不知道MaTnT选择性剪切是不是导致这些效应的唯一分子因素，或者MaTnT剪切的变化由一套其它分子因素所调节.

肌钙蛋白主要通过TnT结合于原肌球蛋白上(tropomyosin)[13－14].由于兔子骨骼肌中TnT和原肌球蛋白交互调节表达[15]，因此MaTnT的变化可能伴随着其它收缩和调节蛋白的改变，这些蛋白与MaTnT一起引发松墨天牛肌肉收缩行为.肌钙蛋白基因在松墨天牛幼虫、蛹和成虫中都有表达，说明肌钙蛋白基因在松墨天牛的整个发育过程中起重要作用;在成虫触角中表达最高，可能与触角觅食、求偶中发挥的功能有关;在足中表达量也较高，这是与足的运动功能相适应的.

本研究获得了松墨天牛的1个转录本，但梅利蜻蜓的飞行肌中含有由单一TnT基因转录而成的6种选择性剪切转录本[6]，由此我们推测松墨天牛肌纤维中也有可能存在多种TnT转录本，它们与其它调控因子共同影响肌肉的收缩.但MaTnT有多少转录本，MaTnT转录的时空表达模式如何，以及MaTnT如何与原肌球蛋白互作等需要进一步研究.

综上，昆虫肌钙蛋白基因的功能研究较少，很多内容具有不确定型，需要深入探讨，本文首次克隆了松墨天牛肌钙蛋白基因，并从生物信息学角度对基因进行了分析，以后的研究可以此为参考，阐明松墨天牛肌肉收缩和行为机理，以丰富昆虫肌肉生理学内容.

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