杨谷良，范媛媛，邓先珍,2

（1.黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000；2.湖北省林业科学研究院，湖北 武汉 430075）

热激处理对甜柿外植体总酚含量和PAL、PPO、POD活性的影响

杨谷良1，范媛媛1，邓先珍1,2

（1.黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000；2.湖北省林业科学研究院，湖北 武汉 430075）

甜柿在组织培养过程中极易褐化，为了防止褐变，在培养之前应对外植体进行热激处理。文中研究了热激处理后的宝华甜柿叶片在培养过程中其酚类物质含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）活性的变化情况，并对热激处理抑制组培褐变的生理机制进行了初步探讨。结果表明：热激处理后，宝华甜柿叶片的褐变程度比没有处理的明显减轻，其总酚含量与苯丙氨酸解氨酶（PAL）及多酚氧化酶（PPO）活性均有所降低，但热激处理对其过氧化物酶（POD）活性的抑制效果并不明显，说明热激处理通过降低外植体的PAL及PPO活性，抑制酚类物质的合成及氧化，减少了褐变产物——醌类物质的形成，从而有效抑制了褐变现象的发生。

宝华甜柿；热激处理；褐变；酚类物质；组织培养

柿Diospyros kakiL.f是柿科Ebenaceae柿属Diospyros的一种果树，在我国广大地区都有栽培。据罗正荣等人的研究文献，我国栽种柿树的历史已有2 000多年[1-2]，我国是世界上栽培柿树最早的国家。宝华甜柿是原产于湖北省罗田县并于2001年通过良种审定的一个地方品种，宝华甜柿在果实生长发育过程中不需要经过任何人工处理而能自然脱涩，是我国最先审定的一个甜柿品种，而且该品种的果实可以长期贮藏，具有巨大的发展潜力[3]。

近年来，柿树栽培面积逐渐扩大，社会上对于良种甜柿苗的需求量也急剧增加。由于甜柿具有单性结实的特性，正常情况下形成的种子数量比较少，嫁接繁殖时存在与砧木亲和力低等不足，所以，采用组织培养措施进行甜柿良种的快速繁殖具有一定的理论意义和重大的生产实际意义。但是，在甜柿组织培养过程中，外植体存在着较严重的褐变现象[4-5]，张妙霞等人[4]以甜柿嫩芽为实验材料进行组织培养时，外植体的褐变率达到90%，严重影响了组织培养的繁殖效率。有不少学者认为，在组织培养时，对培养材料进行适度的热激处理，能够降低培养材料内总酚的含量，从而能有效减轻褐变的程度[6-7]。然而，查阅文献资料后发现，目前关于热激处理抑制褐变的研究主要集中在草本植物上，而对于木本植物特别是柿树的研究报道却相对较少。为了消除甜柿培养过程中褐变的影响，以罗田地方品种宝华甜柿新生叶片为实验材料，以MS(1/2N)＋ZT 2.0 mg/L＋TDZ 0.1 mg/L为诱导愈伤组织的培养基，通过比较对照组（未经热激处理，其他条件相同）与热激处理组叶片外植体组培褐变程度，分析热激处理对酚类物质含量和PAL、PPO、POD活性的影响情况，以期揭示热激处理抑制甜柿组培时外植体褐变的生理机制，从而为通过组织培养进行甜柿工厂化育苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

所选实验材料来自无菌条件下培养的叶片完全没有褐变的宝华甜柿幼苗。在取样之前，先将带有叶片的枝条于45 ℃下热激处理30 min，然后选取成熟度基本一致的叶片，将叶片剪成1.0 cm2大小，按每瓶接种3个外植体的标准，将剪好的叶片均匀地接种于MS（1/2 N）＋ZT 2.0 mg /L＋ TDZ 0.1 mg/L的培养基上进行培养。对照组的叶片没有经过热激处理，其他处理方式和培养条件与实验组完全一致。对照组与实验组的接种量均为50 瓶，共150个叶片，接种好后全部放入智能光照培养箱中进行培养，培养温度为（25.0±0.3）℃，培养过程中，光照强度为（40±5）μmol·m－2s－1，每天光照时间为12 h。分别在培养第0、6、12、18、24天随机取出4瓶共12个叶片，测定其酚类物质含量和PAL、PPO、POD活性，每个指标重复测定3次。

1.2 测定方法

参照有关文献报道的方法[8-10]检测了总酚含量和苯丙氨酸解氨酶( phenylalanine ammonialyase，PAL )、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)及过氧化物酶( peroxidase，POD) 活性等指标。

2 结果与分析

检测中发现，随着培养时间的延长，处理组和对照组的褐变程度都有所增加，但是经过热激处理后，外植体的褐变程度比对照组明显降低，总酚含量和PAL、PPO和POD的活性也均低于对照组。热激处理对甜柿品种组培褐变过程中总酚含量和PAL、PPO和POD活性的影响情况分别如图1～4所示。

图 1 热激处理对甜柿品种组培褐变过程中总酚含量的影响Fig. 1 Effect of hot shock treatment on total phenols content during D. vaki explants browning

图 2 热激处理对甜柿品种组培褐变过程中PAL活性的影响Fig. 2 Effect of hot shock treatment on PAL activity during D. vaki explants browning

图 3 热激处理对甜柿品种组培褐变过程中PPO活性的影响Fig. 3 Effect of hot shock treatment on PPO activity during D. vaki explants browning

图 4 热激处理对甜柿品种组培褐变过程中POD活性的影响Fig. 4 Effect of hot shock treatment on POD activity during D. vaki explants browning

2.1 总酚含量

促使褐变的发生，氧、酶和底物（酚类物质）缺一不可，酚类物质含量的高低将影响褐变程度的轻重。由图1可知，处理组和对照组总酚含量的变化均比较平缓，经过热激处理后，外植体内的总酚含量在培养的第6、12、18、24天表现出逐渐降低的趋势。和对照组相比较，热激处理后外植体中的总酚含量比对照组分别降低了32.1%、50%、51.6% 和54.7%。

2.2 PAL活性

图2显示的是在培养期间经热激处理的宝华叶片外植体中PAL活性的变化情况。由图2可知，与对照组相比，在培养的第0天到第24天，热激处理后外植体内PAL的活性一直低于对照组；在培养的第1～6天，对照组的PAL活性快速增加，而热激处理后的外植体并没有表现出这一特性。

2.3 PPO活性

图3是处理组和对照组的外植体在培养过程中PPO活性的变化情况。从图3中可以看出， 热激处理组外植体的PPO活性的变化趋势相对比较平缓，在整个实验期间，热激处理组外植体的PPO活性一直都比对照组的低，在培养的第0、12、18、24天，处理组外植体的PPO活性比对照组分别低了33.3%、9.5%、53.8% 和33.3%，这表明热激处理能够抑制外植体内PPO的活性。

2.4 POD活性

不管是热激处理组还是对照组，POD活性均呈现出逐渐增加的变化趋势。但是，在整个观测过程中，处理组的POD活性均比对照组低，而且这种差异呈现出逐渐扩大的趋势，在培养的第24天处理组外植体的POD 活性比对照组降低了15.26 μmol·mg－1min－1（见图 4）。

2.5 相关性分析

对宝华外植体中总酚含量、酚合成的代谢酶类进行了相关性分析，结果见表1。由表1可知，总酚含量与PAL、PPO、POD活性的相关系数分别为－0.605 3、0.128 3、－0.596 9，其中，PPO与总酚的合成呈正相关性，PAL、POD则表现出负相关性，PPO与总酚合成的相关性最大。

表 1 总酚含量与PAL、PPO和POD活性的相关性分析结果Table 1 Correlation analysis between total phenols content and activities of PAL, PPO and POD

3 结论与讨论

热激处理是指当植物在超过它正常生长温度10～15 ℃的环境中处理一定时间后，植物体内将会合成热激蛋白（heat shot protein, hsp），防止自身受到伤害。Kanabus等人[11]研究发现，悬浮培养的马铃薯细胞经过42 ℃处理一定时间后，细胞内的hsp大量合成，而其它蛋白的合成却受到明显抑制。但是，在单位时间内，由于细胞合成蛋白的总量是有限的，所以，大量热激蛋白的合成，将会抑制细胞内其它蛋白的合成，或者使变性的蛋白发生降解。热激诱导后，外植体内PAL蛋白的翻译受到了抑制，或者通过加速PAL的代谢，从而降低了PAL的活性。随着热激过程的结束，对PAL合成的抑制作用逐渐解除，外植体内PAL的含量不断增加，在表型上表现为褐化程度逐渐增加。

PPO和POD都是参与植物防御反应的酶。余亮等人[12]研究认为，酚类物质经酚氧化酶（PPO或POD）氧化形成醌类物质，醌类物质再经聚合生成褐色物质，从而导致褐变的发生。组织培养过程中，由于外植体受到机械和渗透等方面的影响，PPO和POD的合成水平会有所增加，但是，经过热激处理后，蛋白质合成水平受到抑制，故能减轻褐变的发生。Fukumoto等人[13]在50 ℃条件下对鲜切莴苣进行处理后发现，处理后的莴苣在贮藏过程中其PPO和POD的活性显著降低，从而得出PPO和POD的合成在热激条件下受到了抑制。

相关性分析结果表明，总酚含量与PPO活性呈正相关，而与POD活性呈负相关。这可能因为，在培养的甜柿外植体中，主要是由PPO催化酚类物质氧化形成醌。张兰等人[14]在研究蚕豆褐变酶促机理时也发现，酚类物质的合成与PPO有正相关性。由此可见，热激处理抑制了PPO活性的增强，能限制酚类物质的催化氧化，这可能是热激处理减轻宝华甜柿组培褐变程度的主要原因之一。

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Effects of heat shock treatment on total phenol content and PAL, PPO,POD activities inDiospyros vakiexplants

YANG Gu-liang1, FAN Yuan-yuan1, DENG Xian-zhen1,2
(1.Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, Hubei, China; 2.Hubei Academy of Forestry, Wuhan 430075, Hubei, China)

The explants ofDiospyros vakiis easy to occur browning during tissue culture process. In order to prevent browning, explants should be treated by heat shock before cultivation. Phenols content and activities of PAL, PPO and POD inD. vakic.v. ‘Baohuatianshi’ leaves were researched, and physiological mechanism of heat shock treatment preventing browning was discussed. The results showed that browning degree of leaves was decreased significantly after heat shock treating, and total phenol content and activities of PAL and PPO were also lower than the control. But preventing effect of hot shock treatment on POD activity was not obvious. It suggested that heat shock treatment could inhibit synthesis and oxidation of phenols, and decreased quinones content, which was browning production, through reducing activities of PAL and PPO in explants. So heat shock treatment could effectively prevent browning.

Diospyros vakic.v. ‘Baohuatianshi’; heat shock treatment; browning; phenols; tissue culture

S682.31 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2015)01—0115—04

2014-06-27

国家“十二五”科技支撑计划项目（2013BAD14B05）；国家公益性行业（农业）科研专项（201503240）。

杨谷良，副教授，博士。

邓先珍，研究员。E-mail：1124675534@qq.com

杨谷良,范媛媛,邓先珍.热激处理对甜柿外植体总酚含量和PAL、PPO、POD活性的影响[J].经济林研究,2015,33(1)：115－118.

[本文编校：伍敏涛]