代文婷 李爱军 郑 楠 王加启*

(1.吉林大学动物科技学院，长春 130062;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部奶产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100193;3.农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)，北京 100193;4.唐山市畜牧水产品质量监测中心，唐山 063000)

乳蛋白是最富有营养价值的蛋白质之一，也是衡量牛奶品质的重要指标，可分为酪蛋白和清蛋白，其中酪蛋白含量较多，约占80%。常见的酪蛋白一般有4种，分别是αs1－酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2 － 酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)、β －酪蛋白(β-casein，CSN2)和 κ －酪蛋白(κ-casein，CSN3)［1］，分别约占酪蛋白总量的 38% 、10% 、36%和12%［2］，其中 CSN3是唯一含有乳糖成分且对钙不敏感的酪蛋白。研究表明，CSN3基因的表达对维持大鼠细胞中COP9信号小体(CSN)的完整性、保证细胞存活、维持乳腺细胞形态都至关重要，而且CSN3基因敲除的雌鼠不能哺乳，甚至丧失泌乳性能，因此CSN3基因是哺乳动物泌乳和繁殖所必需的［3－4］。一直以来，奶牛养殖者一直致力于牛奶中蛋白质含量的提高，进而提升牛奶的营养价值。

根据动物体的生长和氮代谢平衡特点，氨基酸通常被分为必需氨基酸(essential amino acids)和非必需氨基酸(non-essential amino acids)，亮氨酸就属于必需氨基酸。Wu［5］于2010年提出功能性氨基酸(functional amino acids)的概念，即那些能调控生物体内关键的代谢通路，以改善动物体的生理健康，促进其生长发育，调控其泌乳以及生殖的氨基酸。而亮氨酸在机体中发挥着重要的营养生理作用，也是一类功能性氨基酸。概括起来主要功能包括3个方面，即氧化供能、调节机体免疫和调节机体(尤其是骨骼肌)蛋白质代谢［6］。

目前，大多有关氨基酸影响乳腺上皮细胞蛋白质合成的研究集中于对酪蛋白合成相关基因的影响，例如当培养基中蛋氨酸浓度为57 mg/L时，CSN1S1的mRNA的表达水平最高［7］;当培养基中精氨酸浓度为556.00 mg/L时，CSN3的表达量达到最高［1］。而亮氨酸对蛋白质合成的调控研究最早致力于骨骼肌细胞，主要采用灌注或者静脉注射的方法。Dardevet等［8］研究发现，注射亮氨酸的大鼠或新生仔猪的骨骼肌蛋白质合成显著增加，补充亮氨酸比其他必需氨基酸要更有利于氨基酸的利用与骨骼肌的合成。研究发现亮氨酸能通过哺乳动物类帕霉素(mTOR)－真核起始因子4E(eIF4E)－核糖体蛋白S6(RPS6)信号通路来调控骨骼肌蛋白质的合成［9－11］和乳腺组织中蛋白质的合成［12－14］。此外，酪氨酸激酶(JAK)－ 转录激活因子(STAT)路径是多种细胞因子共用的信号通路途径，其广泛参与细胞生长、增殖、应激、凋亡等，可将细胞膜的信号直接传递到细胞核内，启动基因 的 转 录。 目 前，Hu 等［15］研 究 发 现，0.900 0 mmol/L的精氨酸能显著上调乳腺细胞中蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)和转录激活因子5(STAT5)的基因表达，从而调控蛋白质的转录过程。最新研究还发现，与其他组合相比，当赖氨酸与蛋氨酸的比例为3∶1(赖氨酸为1.2 mmol/L，蛋氨酸为0.4 mmol/L)时，JAK2和STAT5基因表达显著上调［5，14］。亮氨酸对骨骼肌蛋白质调控机制已经很清楚，而不同水平的亮氨酸对乳腺上皮细胞的增殖以及乳蛋白的合成调控作用还不是很透彻。本研究旨在以奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究不同水平的亮氨酸对其增殖以及泌乳相关基因表达的影响，进而能为亮氨酸对乳中酪蛋白合成的调控机理提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

1.1.1 主要试剂

DMEM/F12培养基(Gibco，货号:11995－065/11765－054)、缺亮氨酸的 DMEM/F12培养基(Gibco定制，货号:CM028817)、L－亮氨酸(Sigma，货号:L8912 －100G)、胎牛血清(FBS，Gibco，货号:10099－141)、胰蛋白酶(碧云天生物技术研究所，货号:C0203)、噻唑蓝(MTT，Sigma，货号:0793 －5G)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma，货号:D4540)、青链霉素(碧云天生物技术研究所，货号:C0222)、RNA提取试剂盒(TIANGEN，货号:74106)、反 转 录 试 剂 盒 (TaKaRa，货 号:DRR037A)、实时定量 PCR试剂盒(TaKaRa，货号:DRR820A)。

1.1.2 主要仪器

恒温CO2培养箱(美国Thermo)、超净工作台(江苏苏净集团有限公司)、冷冻离心机(德国Legend)、酶标仪(美国 Gene)、实时定量 PCR仪(美国ABI7500)、倒置显微镜(日本 Olympus)、细胞计数仪(美国Bio-Rad)、RNA浓度测定仪(美国Thermo)等。

1.2 奶牛乳腺上皮细胞的培养方法

荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞培养方法参照本实验室前期建立的奶牛乳腺上皮细胞培养方法［15］。采取1头3周岁泌乳中期奶牛的乳腺组织，通过组织块接种法对奶牛乳腺上皮细胞进行体外分离培养，经纯化可得到细胞形态均一的奶牛乳腺上皮细胞并处于正常的生理状态，且具有正常的分泌功能。将奶牛乳腺上皮细胞置于含有10%胎牛血清的 DMEM/F12生长培养基中(pH 7.4)，在38℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞长满培养皿，达到80% ～90%汇合时，用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液于38℃、5%CO2的恒温培养箱中消化待细胞质回缩，细胞间隙增大缩成圆形时(8～15 min)，用培养基终止消化反应;用移液器反复吹打后，收集细胞悬液于15 mL离心管，500×g室温离心5 min;弃上清液，加入新鲜的DMEM/F12生长培养基，制成细胞悬浮液。

1.3 细胞增殖检测

1.3.1 种板

收集第4或5代乳腺上皮细胞，使用加入胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮细胞，调整细胞密度为 1×105个/mL接种到 96孔板中，每孔200μL，四周边缘孔加入无菌D-Hanks缓冲液，置于38℃、5%CO2培养箱贴壁培养24 h。

1.3.2 换液

24 h后吸去各孔内的培养基，用无菌D-Hanks缓冲液洗各孔2遍，向各孔中加入200μL不同水平亮氨酸的培养基(表1)，培养基中不添加胎牛血清。以不添加亮氨酸的为对照组(0×组)，每组设置3个重复孔，每板均设对照组。

1.3.3 MTT 法检测细胞增殖

分别于接种后24、48、72 h小心吸去培养基，然后各孔加入MTT工作液(5 mg/mL)20μL，4 h后弃去上清，每孔中加入二甲基亚砜200μL，振荡5 min后采用全自动酶联免疫分析仪检测各孔590 nm波长下的吸光度值(OD590nm)。细胞相对增殖率(relative proliferation rate，RGR)计算公式:

RGR=试验组OD590nm/对照组OD590nm［5］。

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1.4 实时定量PCR法检测CSN3合成相关基因的表达

1.4.1 铺板

收集第3或4代乳腺上皮细胞，使用加入胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮细胞，调整细胞密度为5×105个/mL接种到6孔板中，每孔1.5 mL，共接种27个孔，置于37℃、5%CO2培养箱贴壁培养24 h。

1.4.2 换液

24 h后，吸去各孔内的培养基，用无菌D-hanks润洗各孔2遍，然后加入不同水平亮氨酸的培养基，每组设置3个重复，继续培养24 h。

1.4.3 总 RNA 提取

继续培养24 h之后，使用总RNA提取试剂盒(QIAGEN RNeasy Mini Kit)提取细胞总RNA，每个孔单独提取，共提取27个孔，提取的总RNA经浓度测定和纯度检测合格后立即进行反转录。利用TaKaRa反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix)将总RNA反转录为cDNA，以用于下一步的实时定量PCR。

1.4.4 CSN3合成相关基因的表达检测

试验所用引物设计见下表2。选用核糖体蛋白S9(RPS9)作为内参基因。选用TaKaRa实时定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)，反应体系为20μL:10μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)、ROX Reference DyeⅡ(50 ×)0.4 μL，0.6 μL上游引物，0.6 μL 下游引物，2 μL cDNA模板，6.4μL双蒸水。反应程序:95℃，30 s;95℃，5 s，60 ℃退火延伸 34 s，40 个循环，熔解曲线程序为:95 ℃，15 s;55 ℃ ，1 min，95 ℃，15 s。

1.5 统计学方法

采用SAS 9.2软件PROC ANOVA对数据进行方差分析，均值多重比较采用Duncan氏法，以P＜0.05为显著性检验水平。统计所得数据以平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 培养基中亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

由表3可知，孵育24和48 h，培养基中添加亮氨酸能够提高乳腺上皮细胞相对增殖率，0.25×组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，而其余各组均显著高于对照组(P＜0.05);孵育72 h，各亮氨酸添加组与对照组相比，细胞相对增殖率差异均显著提高(P＜0.05)。低水平组(0.25×组～2×组)，细胞的相对增殖率随着亮氨酸水平的升高而增大;3个时间点均以2×组细胞的相对增殖率最大;高水平组(2×组～32×组)，细胞的相对增殖率随着亮氨酸水平的升高而有所下降。结果表明，培养基中添加0.900 0 mmol/L亮氨酸对乳腺上皮细胞的促增殖作用最强，低水平和高水平的 促增殖作用均有所减弱。

表2 实时定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers for real-time PCR

表3 亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞相对增殖率的影响Table 3 Effect of leucine level on of bovine mammary epithelial cell proliferation rate(n=3)

2.2 培养基中亮氨酸水平对乳腺上皮细胞CSN3合成相关基因表达量的影响

由表4可知，各亮氨酸试验组与对照组比较，mTOR、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)、JAK2和STAT5基因的相对表达量均差异显著(P＜0.05);亮氨酸低水平组(0.25×组 ～2×组)mTOR、S6K1、JAK2和STAT5基因的相对表达量随着水平的升高先降低后升高;这4种基因的表达量都以2×组达到最大，继续升高亮氨酸水平，这些基因的表达量均有所下降。然而，亮氨酸处于低浓度水平(0.25×组～2×组)时，4EBP1基因的相对表达量随着水平的升高而降低;4EBP1基因相对表达量以2×组达到最小;随着亮氨酸水平的继续升高，该基因的表达量有所升高。结果说明，亮氨酸能促进奶牛乳腺上皮细胞中mTOR、S6K1、JAK2和STAT5的表达，但是抑制4EBP1的表达。0.900 0 mmol/L(2×组)的亮氨酸水平对mTOR、S6K1、JAK2和STAT5这4种基因的上调表达作用最强，而对4EBP1的下调表达最强。

0.25 ×组、0.5×组、8×组和16×组CSN3基因的相对表达量与对照组比较差异均不显著(P＞0.05)，其他各亮氨酸试验组中CSN3基因的相对表达量与对照组比较差异显著(P＜0.05)，该基因的相对表达量以2×组最大。这说明亮氨酸对CSN3基因表达的促进作用与剂量有关，当亮氨酸水平为0.900 0 mmol/L(2×组)时，该基因的相对表达量最高，上调作用最强，继续升高水平，其表达量有所下降。

表4 亮氨酸水平对奶牛乳腺上皮细胞CSN3合成相关基因表达相对表达量的影响Table 4 Effects of leucine level on the relative expression levels of genes related to CSN3 synthesis(n=3)

3 讨论

3.1 培养基中亮氨酸水平对乳腺上皮细胞增殖的影响

乳腺组织在动物体内的增殖和分化受许多因素如激素、维生素、氨基酸、微量元素、生长因子等的影响，这些因素也能影响体外培养的乳腺上皮细胞的增殖、分化、泌乳等功能［20］。庞学燕等［21］研究表明，24 h时，与不添加亮氨酸的对照组相比，外源添加177.15 mg/L亮氨酸显著促进奶牛乳腺上皮细胞的细胞增殖。徐柏林［1］研究发现24、48和72 h时，添加556.00 mg/L的精氨酸对奶牛乳腺细胞的促增殖作用最强。适宜水平的特定氨基酸在调控细胞增殖的过程中，存在一种时间和水平的最优化效应，一旦超过或者低于这个水平时，其促增殖效应会相应地降低［22］。有研究表明，与添加177.15 mg/L亮氨酸试验组相比，添加LY294002抑制剂(一种能抑制mTOR信号通路的抑制剂)亮氨酸试验组的奶牛乳腺上皮细胞增殖显著降低［23］。王志钢等［22］和 Mercier等［24］均指出 mTOR 信号通路可以介导调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖，继而通过细胞数量来调控乳蛋白的合成。在动物体内，亮氨酸可以在支链氨基酸转氨酶的作用下生成α－酮戊二酸，α－酮戊二酸一方面能调节mTOR的活性，从而有效提高蛋白质的合成效率，有利于细胞的增殖［5－6］;另一方面还能降低蛋白质的分解率，并改善机体的免疫水平，从而促进机体的生长。另外，有一些学者认为α－酮戊二酸还能刺激胰岛素的分泌，进而调控生物体的生长代谢［8］。

3.2 培养基中亮氨酸水平对乳腺上皮细胞CSN3合成相关基因表达量的影响

CSN3是一种表达相对稳定的酪蛋白基因，因而本试验以CSN3为中心来探索乳蛋白合成相关基因的表达。氨基酸对酪蛋白合成影响主要表现在2个方面:转录水平调控和翻译水平调控。酪蛋白基因的转录过程主要由信号转换和STAT5调控［25］，JAK2 能磷酸化 STAT5，继而使 STAT5 形成二聚体，转位进入细胞核并能与核内的特异序列结合［26－27］。氨基酸对酪蛋白表达调控主要是通过mTOR信号通路介导，氨基酸主要通过激活哺乳动物雷帕霉素靶标复合物1(mTORC1)，一方面促使核糖体蛋白S6激酶的磷酸化并激活，继而促进mRNA的翻译;另一方面促使4EBP1发生磷酸化，释放eIF4E，启动mRNA的翻译起始，而未发生磷酸化的4EBP1与 eIF4E相结合，抑制eIF4E 与 eIF4G 的结合［28］。

庞学燕［23］研究了不同水平亮氨酸对CSN3表达的影响，发现水平为 118.1～236.2 mg/L时CSN3基因的表达显著高于其他组。Arriola等［13］和Appuhamy等［14］研究发现，培养基中单独添加亮氨酸和必需氨基酸，奶牛乳腺上皮细胞中mTOR、S6K1 以及 4 种酪蛋白 CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3的基因表达量显著上调，而与酪蛋白合成相关的4EBP1基因表达量也都显著下调。此外，Rius等［29］给饥饿处理36 h后的泌乳中期奶牛静脉灌注氨基酸，发现乳腺组织中mTOR和S6K1的磷酸化程度显著提高，而4EBP1的磷酸化显著降低，同时乳蛋白的合成量也有所提高，这表明mTOR通路能够调控乳蛋白产量［6］。这些为进一步研究氨基酸对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的机制提供了理论依据。

本试验采用实时定量PCR方法检测添加不同水平的亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞中CSN3合成相关基因的表达。结果表明，在缺少亮氨酸的培养基中添加水平范围为0.112 5～14.400 0 mmol/L(0.2×组～32×组)的亮氨酸，与对照组相比，mTOR、S6K1、4EBP1、JAK2 和 STAT5 基因均显著上调表达;除了0.25×组、0.5×组、8×组和16×组CSN3基因的相对表达量与0×组比较差异均不显著外，其他各亮氨酸试验组中CSN3基因表达量与对照组比较差异显著。但是不同水平亮氨酸对CSN3合成相关基因的促进效果不同，当亮氨酸水平为 0.900 0 mmol/L(2 × 组)时，mTOR、S6K1、JAK2、STAT5和CSN3基因表达量均达到最高，而4EBP1基因表达量最低。这与前人庞雪燕等报道的一致［18，24］。另外，本试验结果还表明，对于低水平亮氨酸组(0.25×组～1×组)，随着亮氨酸水平的增加，各酪蛋白相关合成基因的相对表达量随之升高(4EBP1呈现下降的趋势);对于高水平亮氨酸组(4×组～32×组)，随着亮氨酸水平的增加，各酪蛋白合成相关基因的相对表达量随之降低(4EBP1呈现升高的趋势)。这说明亮氨酸在调控CSN3合成相关基因表达时存在剂量效应和最优化效应;这种效应可能是由于亮氨酸需借助相应的转运载体进入乳腺细胞内继而发挥对mTOR通路的调控作用，而细胞膜表面的亮氨酸转运载体数量是有限的，这就从一定程度上限制了亮氨酸调控作用的不断提高。

4 结论

亮氨酸能促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖和CSN3合成相关基因的表达。奶牛乳腺上皮细胞的相对增殖率和CSN3合成相关基因mTOR、S6K1、JAK2和 STAT5的上调表达作用都以0.900 0 mmol/L亮氨酸达到最强，而此水平下4EBP1的基因表达量达到最低。

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