王运斌，江良荣，黄荣裕，黄育民，郑景生

（厦门大学生命科学学院，福建厦门361102）

随着分子标记技术的快速发展，聚合酶链反应（PCR）结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术已广泛应用于水稻遗传连锁图谱构建、基因定位克隆、分子标记辅助育种、遗传多样性分析等研究领域，但非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳常规银染法比较复杂、耗时费力、成本高、效率低，不利于进行大规模批量样品材料分析或育种材料选择。因此，许多研究者根据大规模分子标记分析工作的实验需要，从减少操作步骤、减少显带时间、降低药品成本、提高分辨率等方面对常规银染法进行了改进[1-9]。研究基于本实验室长期应用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳常规银染法[10]的基础上进行改进和简化银染步骤，建立了一种高效节本的批量快速银染法，能极大提高遗传图谱构建、基因定位、分子标记辅助育种等大规模样品分子标记分析检测的效率，大幅度减少检测成本。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为随机选取的水稻“航2号”与“象牙香占”杂交建立的BC3F2分离群体部分单株分蘖期叶片。引物为王丰等[11]设计开发的InDel功能标记GRFM04。DNA提取参考王兰等[12]的基因组DNA快速制备方法。

1.2 PCR反应体系和程序

PCR反应体系总体积为11 μL，其中10×buffer1.1 μL，2.5 mmol/LdNTPs 0.8 μL，5 U/μLTaq酶 0.1 μL，正反引物各0.05 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 7.9 μL。

PCR反应在Biometra Tprofessional Thermocycler PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3 PCR产物的电泳分离

PCR产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，具体参考郑景生等[10]的方法，采用垂直电泳槽电泳，每块凝胶的大小约为长12.5 cm、高18 cm、厚1.0 mm，电泳条件为电压340V电泳2 h左右，然后采用常规银染法和改进银染法进行染胶并照相保存。

1.4 银染方法

电泳结束后取下胶板，分别按下述银染方法各染1块凝胶，染色液各为100 mL，所用染胶盘的规格为长20 cm、宽30 cm、高5.5 cm的搪瓷盘，记录染色时间（不包括剥胶时间）。

1.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶常规银染方法 ①固定：90 mL蒸馏水加入10 mL乙醇，放入凝胶，加500 μL冰乙酸，摇动3 min；②染色：加入1 mL20%的硝酸银溶液，摇动5～8 min；③漂洗：倒掉染色液，蒸馏水漂洗2～3次，洗净后，倒掉蒸馏水；④显影：在染胶盘中加入100 mL 3%NaOH溶液 （100 mL蒸馏水+3 g NaOH） 和500 μL甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，放入凝胶显影3～5 min；⑤洗涤：显影后，倒掉显影液，用蒸馏水漂洗2～3次；⑥显影后的凝胶平置于玻璃板上，记录PCR产物带型；晾干后可进行拍照，亦可覆盖保鲜膜长久保存。

1.4.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶银染方法改进一 ①固定染色：染胶盘中加入100 mL蒸馏水和500 μL20%硝酸银溶液，放入凝胶，摇动8～10 min；②漂洗：倒掉染色液，用蒸馏水漂洗2～3次；③显影：在染胶盘中加入100 mL 0.5%NaOH溶液（100 mL蒸馏水+0.5 g NaOH）、0.019 g四硼酸钠和400 μL甲醛，迅速震荡，使显影液充分作用，摇动3～5 min；④洗涤：显影后，倒掉显影液，用蒸馏水漂洗2～3次；⑤显影后的凝胶平置于玻璃板上，记录PCR产物带型；晾干后可进行拍照，亦可覆盖保鲜膜长久保存。

1.4.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶银染方法改进二 ①固定染色：染胶盘中加入100 mL蒸馏水和500 μL20%硝酸银溶液，放入凝胶，摇动8～10 min；②显影：加入0.5 g NaOH、0.019 g四硼酸钠以及400 μL甲醛溶液，摇动3～5 min；③洗涤：显影后，倒掉显影液，用蒸馏水漂洗2～3次；④显影后的凝胶平置于玻璃板上，记录PCR产物带型；晾干后可进行拍照，亦可覆盖保鲜膜长久保存。

1.4.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶银染方法改进三 ①固定染色：染胶盘中加入100 mL蒸馏水和500 μL20%硝酸银溶液，放入凝胶，摇动8～10 min；②显影：加入0.5 g NaOH以及400 μL甲醛溶液，摇动3～5 min；③洗涤：显影后，倒掉显影液，用蒸馏水漂洗2～3次；④显影后的凝胶平置于玻璃板上，记录PCR产物带型；晾干后可进行拍照，亦可覆盖保鲜膜长久保存。

1.4.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶银染方法改进四 ①固定染色：染胶盘中加入100 mL蒸馏水和500 μL20%的硝酸银溶液，放入凝胶，摇动8～10 min；②漂洗：倒掉染色液，用蒸馏水漂洗2～3次；③显影：在染胶盘中加入100 mL 0.5% NaOH溶液（100 mL蒸馏水+0.5 g NaOH）和400 μL甲醛，迅速震荡，使显影液充分作用，摇动3～5 min；④洗涤：显影后，倒掉显影液，用蒸馏水漂洗2～3次；⑤显影后的凝胶平置于玻璃板上，记录PCR产物带型；晾干后可进行拍照，亦可覆盖保鲜膜长久保存。

2 结果与分析

2.1 不同银染方法的染色效果

不同非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法的染色效果见图1～5，看出：常规银染法（图1）与改进银染法一（图2）、改进银染法四（图5）的胶片背景比较清晰，分辨率高，条带容易分辨，能准确判断带型；改进银染法二（图3）与改进银染法三（图4）的胶片背景比较模糊，分辨率较低，表面存在成片的白色物质，较难准确判断带型。

图1 常规银染方法的染色效果

图2 银染改进方法一的染色效果

图3 银染改进方法二的染色效果

图4 银染改进方法三的染色效果

图5 银染改进方法四的染色效果

2.2 不同银染方法的优缺点

不同非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法染1块凝胶的染色液用量均为100 mL，染色时间基本相近（表1），但操作步骤、试剂用量有所不同（表 2）。

从表1看出，常规银染方法的操作繁琐、染色时间较长，全程约需16.5 min。银染改进方法一与银染改进方法四简化步骤，将固定和染色两步骤合并，简化操作，染色时间约需16 min。银染改进方法二与银染改进方法三的银染步骤更加简化，除将固定和染色两步骤合并外，还省去了漂洗步骤，操作更加简便，染色时间最短，约需15 min。可见，银染改进方法简化了操作步骤、缩短了染色时间，有利于提高工作效率。

表1 不同银染方法的染色时间

表2显示，常规银染方法所消耗的试剂最多，银染改进方法的各种试剂用量大幅度减少。与常规银染方法相比，银染改进方法省去了无水乙醇与冰乙酸的使用，硝酸银、氢氧化钠和甲醛的用量分别减少1/2、5/6、1/5，实验成本大幅度降低，减少醋酸、甲醛等刺鼻气味对人体健康的影响，减少废弃液对环境的污染。但银染改进方法一和银染方法二又增加了四硼酸钠的使用，也相应增加了实验成本。

如在染色过程中，硝酸银是最重要的试剂，其价格昂贵，一瓶规格为25 g的硝酸银（上海生工）价格为226元，配制成20%硝酸银溶液为125 mL，若按表2的硝酸银使用剂量来计算，常规银染方法只能染胶125块，每块胶的硝酸银成本约1.8元，但银染改进方法均可染胶250块，每块胶的硝酸银成本约0.9元，为常规银染方法的一半。此外，银染改进方法不再需要无水乙醇和冰乙酸，同时减少了氢氧化钠和甲醛的使用量。

由此可见，银染改进方法不仅节省大量成本，而且减少了对人体和环境的影响。综合以上结果分析，认为银染改进方法四是本研究中最佳的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法。

表2 不同银染方法的试剂使用量

3 讨论

目前大多数的分子标记遗传连锁图谱构建、基因定位克隆、分子标记辅助育种、DNA指纹分析等研究涉及的PCR扩增产物多数采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染确定，其染色胶片的质量对条带的准确统计、结果分析非常重要。若胶片背景模糊、条带不易辨别判断，很容易导致统计结果错误，进而影响分析结果的准确性。此外，传统的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法操作繁琐、耗时费力、成本高、效率低，难以大批量操作，不利于进行大规模批量样品材料分析或育种材料选择，影响实验进展。因此，实验室对非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳常规银染方法进行改进，筛选出在不影响染胶效果的基础上可进行大批量银染、大幅度降低实验成本的银染方法。

研究结果表明，5种非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染方法中银染改进方法二和银染改进方法三的染色胶片背景较为模糊、带型不易辨别，不宜采用。常规银染方法、银染改进方法一和银染改进方法四的染色胶片背景清晰、条带清楚易于辨别，但常规银染方法的操作繁琐、消耗试剂多、成本高，而银染改进方法一比银染改进方法四有增加了四硼酸钠的使用。因而，研究认为，银染改进方法四是最佳的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法，具有操作简便、实验成本低、胶片背景清晰、条带清楚等特点，值得推广。

为加快实验进程、提高工作效率，在实际操作过程中，实验室习惯采用批量银染方法，即每批次可染胶2～20块，可大幅度提高染胶效率。本实验室常用的批量银染方法是，采用上述的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染改进方法四，当染胶数量为10～20块时，试剂和染色液的用量均减半，即只需按染胶数量的一半来配制染色液数量。如要染胶10块，则只需配制5块胶的染色液数量500 mL即可满足需要，而染胶效果基本不受影响。因此，批量银染可大幅度节约试剂、降低成本、缩短时间、加快实验进度，提高实验效率，取得事半功倍的效果。

[1]王凤格，赵久然，郭景伦，等.一种改进的玉米SSR标记的PAGE/快速银染检测新方法[J].农业生物技术学报，2004，12（5）：606-607.

[2]宋显军，张 伟，曹萍，等.大豆SSR标记PAGE银染方法的改进[J].安徽农业科学，2006，34（16）：3922-3923.

[3]关海涛，徐世昌，郭玉华.两种聚丙烯酰胺凝胶银染方法的比较[J].沈阳农业大学学报，2006，37（1）：86-87.

[4]梁宏伟，王长忠，李忠，等.聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的建立[J].遗传，2008，30（10）：1379-1382.

[5]胡建斌，李静，袁鸣，等.PAGE凝胶制备方法和银染方法的改进[J].江西农业大学学报.2009，31（4）：742-745.

[6]高东，杜飞，朱有勇.低背景、高分辨率PAGE简易银染法[J].遗传，2009，31（6）：668-673.

[7]蔡辉儒，李忆，蒲志刚，等.一种简易银染程序的确定与优化[J].湖南农业科学，2009（1）：46-48.

[8]王竹林，杨睿，刘联正，等.聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响因素[J].实验室研究与探索，2011，30（9）：15-17.

[9]靳容，后猛，马代夫，等.甘薯AFLP扩增产物的PAGE 胶快速银染法[J].江苏 农业科学，2013，41（2）：30-32.

[10]郑景生，吕蓓.PCR 技术及实用方法[J].分子植物育种，2003，1（3）：381-394.

[11]王丰，李金华，柳武革，等.一种水稻香味基因功能标记的开发[J].中国水稻科学，2008，22（4）：347-352.

[12]王兰，龙云铭，刘耀光.一种用于PCR的植物基因组 DNA 快速制备方法[J].分子植物育种，2009，7（2）：425-428.