胡飞，胡本进，李昌春，周子燕，徐丽娜，李瑞雪

(1．安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽 合肥 230031;2．安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽 合肥 230031)

油茶Camellia oleifera Abel．是我国南方重要的经济林树种，在长江流域、西南地区、华南各地有广泛栽培。油茶炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz．，发病具有鲜明的季节性，果实、叶片均可侵染发病，在湖南、安徽等油茶主要分布区发生普遍，引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，造成油茶籽实减产10%～30%，重病区减产40%～50%［1-4］。目前国内主要采用化学药剂防治油茶炭疽病，百菌清、波尔多液、退菌特、甲基硫菌灵、叶斑净(30%苯甲·丙环唑)［5-7］等效果较好。但是化学农药长期使用导致大量农药残留，诱发抗药性，降低茶油质量，同时也污染了生态环境，因此发展高效稳定的生物农药是油茶行业的趋势和方向。利用拮抗微生物防治油茶炭疽病的报道较多，赵秀云［8］等分离的解淀粉芽胞杆菌产生抗菌脂肽对油茶炭疽病具有较好的控制作用;周国英［9-11］等发现拮抗链霉菌F10能影响油茶炭疽病菌菌丝正常生长和分生孢子的萌发，内生枯草芽胞杆菌Y13能诱导油茶相关抗性酶活性的提高，同时对油茶炭疽病也具有较好的防治效果。多粘类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa具有植病防治和促生作用，美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业应用的微生物，常用于防治植物青枯病、枯萎病、黄萎病等，国内利用多粘类芽胞杆菌开发出的生物农药康地雷得对植物枯萎病有较好防效［12-13］。近2 a发现多粘类芽胞杆菌对水稻稻瘟病［14］、小麦根腐病［15］、烟草黑胫病［16］、红辣椒疫病［17］等都具有抑制作用，但防治油茶炭疽病研究尚未见报道。作者以多粘类芽胞杆菌DN-1为试验药剂，测定对油茶炭疽病菌的孢子萌发的影响及其抑菌率，通过林间防治试验探索多粘类芽胞杆菌防治油茶炭疽病的可行性和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 多粘类芽胞杆菌DN-1，于青岛海域海泥中分离(Genebank登录号:KM891591)，由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所保存。

油茶炭疽病病原菌菌株YTJ-1，YTJ-2，YTJ-7，YTJ-14，由安徽皖南地区油茶林病叶中分离并鉴定，经转接、纯化培养后供试。

1.1.2 供试培养基 PDA［18］培养基用于病原菌培养、保存和对峙试验;LB［19］培养基用于DN-1菌株活化;不加琼脂的PD培养液用于病原菌孢子悬液及DN-1菌株种子液制备;液体发酵培养基［20］用于DN-1菌株液体发酵。

1.2 油茶炭疽病菌孢子悬浮液制备将4株油茶炭疽病菌接种于PDA培养基平板上，30℃下培养7 d，加入无菌水从平板上洗脱孢子，以4层灭菌纱布过滤制成孢子悬浮液，稀释成相同浓度备用。

1.3多粘类芽胞杆菌DN-1不同芽胞浓度发酵液制备将经LB培养基活化后的DN-1接入液体种子培养基(PD)中，培养24 h获得种子液，然后按接种量5%转至液体发酵培养基中，37℃培养72 h后获得发酵母菌液。取适量发酵菌液用无菌蒸馏水配置成不同浓度:10，20，40，80，160亿芽胞/L。于4℃下保存备用。

1.4 多粘类芽胞杆菌DN-1对4株油茶炭疽病菌株孢子萌发的影响试验采用凹玻片法。取无菌凹玻片，先加入1%葡萄糖无菌液、再加入4株油茶炭疽病菌的孢子悬浮液20μL，最后加入不同芽胞浓度的多粘类芽胞杆菌DN-1的发酵液20μL或百菌清(2 g/L)、30%苯甲·丙环唑(0．12 g/L)药液，盖上盖玻片，放入铺有湿润滤纸的培养皿中于28℃下培养24 h，检查孢子萌发情况(当孢子芽管长度大于孢子的短半径时即视为萌发)，每个浓度重复4次，记录孢子萌发情况，计算抑制率。

1.5 多粘类芽胞杆菌DN-1对4株油茶炭疽病菌株抑菌率测定采用纸碟法［21］测试不同芽胞浓度DN-1的抑菌活性。在PDA培养基的平板中央放置1块油茶炭疽病菌饼(直径0．3 cm)，其周围均匀放置4个湿润的纸碟(直径0．3 cm)，5个芽胞浓度及百菌清、30%苯甲·丙环唑药液各取50μL涂抹其上，28℃下培养。每个处理重复4次，以不放置纸碟的处理作对照。待对照的菌落将长满平板时，用卡尺测量菌落直径(cm)。每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各1次，取其平均值，以油茶炭疽病病原菌的生长速度计算抑菌率。

1.6 林间防治试验试验地设在舒城县汤池镇、舒茶镇两地油茶园区。5年生以上茶树，树高2～4 m，行间距2．0～2．5 m。在油茶炭疽病发病初期和高峰期各喷药2次。试验设5个芽胞浓度(终浓度，667 m2用水量50 L)，设百菌清(2 g/L)、30%苯甲·丙环唑(0．12 g/L)、清水3个对照(清水)，每个处理为10株，4次重复，共8个处理，树冠喷施药液。试验期间无喷施其它防治油茶炭疽病类药剂，无异常天气出现。油茶炭疽病发病初期防治试验于2014年4月15日、25日各施药1次，此时油茶炭疽病开始出现;发病高峰期防治试验于7月5日、15日各施药1次。两次试验于第2次施药后30 d检查叶片油茶炭疽病的病情等级和防治效果［22］。

1.7 数据处理用Spass19．0软件对数据进行方差分析，并比较各处理的差异性。

2 结果与分析

2.1 多粘类芽胞杆菌DN-1发酵液对孢子萌发的影响不同芽胞浓度多粘类芽胞杆菌DN-1发酵液对4株油茶炭疽病菌孢子萌发都有抑制作用。其对孢子萌发抑菌率与芽胞浓度呈正相关(见表1)，其中当浓度为(10～160)亿芽胞/L时对4株油茶炭疽病菌菌株的孢子萌发抑菌率41．50%～88．75%，高低浓度处理间差异极显著。当DN-1发酵液浓度为160亿芽胞/L，孢子抑制率87%以上;与百菌清处理差异不显著，低于30%苯甲·丙环唑处理。

表1 多粘类芽胞杆菌DN-1对4株油茶炭疽病菌的孢子萌发抑制率 %

2.2 多粘类芽胞杆菌DN-1发酵液抑菌率测定

抑菌率试验再次表明多粘类芽胞杆菌DN-1对4株油茶炭疽病菌生长有明显抑制作用(见表2)。10亿芽胞/L对4株油茶炭疽病菌抑菌率35．81%～47．78%，随着处理浓度的增加，抑菌率随之增强，160亿芽胞/L的抑菌率75．10%～77．56%，5个浓度处理间抑菌率差异显著;DN-1发酵液160亿芽胞/L抑菌率与百菌清处理相当，差异不显著;而显著低于30%苯甲·丙环唑处理。

表2 多粘类芽胞杆菌DN-1对油茶炭疽病菌的抑菌作用

2.3 林间防治2014年4—7月在汤池镇、舒茶镇两地油茶园区进行的林间防治试验表明，多粘类芽胞杆菌DN-1对油茶炭疽病都具有较好的林间防效(表3，4)，当浓度高于80亿芽胞/L时，两地不同施药时期的林间防效较稳定。

在汤池镇，DN-1浓度为(10～160)亿芽胞/L时，发病初期施药后30 d调查的防效29．80%～68．91%，160亿芽胞/L时防效与对照药剂百菌清无明显差异，但低于对照药剂30%苯甲·丙环唑，差异不明显;发病高峰期施药后30 d调查的防效26．61%～50．20%，160亿芽胞/L浓度与30%苯甲·丙环唑处理间防效差异极显著。在油茶炭疽病发病高峰期施药的林间防效显著低于发病初期施药。

在舒茶镇，DN-1浓度为(10～160)亿芽胞/L时，发病初期施药后30 d调查的防效31．11%～67．55%，160亿芽胞/L浓度林间防效低于30%苯甲·丙环唑处理，差异不显著;发病高峰期施药后30 d调查的防效21．95%～52．66%，160亿芽胞/L浓度处理低于30%苯甲·丙环唑的防效，差异显著。在油茶炭疽病发病高峰期施药的林间防效也显著低于发病初期施药。

表3 多粘类芽胞杆菌DN-1对油茶炭疽病菌的林间药后30 d防治效果(汤池镇)

表4 多粘类芽胞杆菌DN-1对油茶炭疽病菌的林间药后30 d防治效果(舒茶镇)

3 讨论

室内和林间防治试验研究结果表明多粘类芽胞杆菌DN-1对油茶炭疽病能起到较好的防治作用，与报道的枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌一样均可用于油茶炭疽病林间防治。当终浓度达160亿芽胞/L时，DN-1对4株油茶炭疽病菌孢子抑制率87%以上，室内抑菌率75%以上;在油茶炭疽病发病初期施药林间防效70%左右，而在发病高峰期施药仅有50%左右。这说明多粘类芽胞杆菌DN-1具有林间防治油茶炭疽病的应用价值，这不仅拓展了多粘类芽胞杆菌的抑菌谱，也为在油茶绿色防控方面提供了新的菌种资源。

DN-1各浓度处理抑菌率均低于孢子抑制率，这可能与多粘类芽胞杆菌芽胞及发酵液直接与分生孢子作用有关，能较强的抑制分生孢子萌发。当多粘类芽胞杆菌孢子浓度达160亿孢子/L时，在油茶炭疽病发病初期施药可以起到较好的控制作用，与百菌清防效接近，而在发病高峰期施药防效明显下降，两地林间防治效果稳定。这可能是在油茶炭疽病发病初期即病情指数较低时，有利于多粘类芽胞杆菌DN-1竞争占位，快速诱导油茶自身抗病系统启动，从而抵挡病原菌的进一步侵入，也可能是发酵液中抗菌物质能在发病初期较好的抑制病原菌扩展。本次林间试验证明多粘类芽胞杆菌防治油茶炭疽病，应在发病初期施药，这与生物农药预防为先的施用方式相符合。

多粘类芽胞杆菌作用机制多样，既有抗菌多肽、蛋白等起作用，也可通过菌体与病原菌在生态位竞争生存空间和营养物质，还可以与植物相互作用引起植物体内一系列生理生化变化，进而使植物对病害产生抗性［23］。本研究虽然证明了多粘类芽胞杆菌DN-1对油茶炭疽病的生防作用，但对具体起作用的是活菌体还是发酵液中的具体活性物质未做分析，对防治机理也未涉及，以后需要对其在油茶叶片上的定殖动态［24］、发酵液中活性物质分析［25］、以及与油茶抗病性相关酶活的生理指标测定做进一步完善，进而为研制新型油茶炭疽病生物防治药剂奠定基础。

［1］ 刘伟．油茶炭疽病的病原学、发病规律及防治技术研究［D］．武汉:华中农业大学，2012．

［2］ 庄瑞林．中国油茶［M］．北京:中国林业出版社，2008:307-336．

［3］ 杨光道，束庆龙，段琳，等．主要油茶品种对炭疽病的抗性研究［J］．安徽农业大学学报，2004，31(4):480-483．

［4］ 靳爱仙，周国英，李河．油茶炭疽病的研究现状、问题与方向［J］．中国森林病虫，2009，28(2):27-31．

［5］ 郑少华．不同药剂对油茶炭疽病的防控效果［J］．林业科技，2012，37(4):47-49．

［6］ 曹志华，束庆龙，程义明，等．12种农药对油茶炭疽菌的室内毒力测定［J］．农药，2012，51(4):304-306．

［7］ 陈绍红，孙思，王军．14种杀菌剂对油茶炭疽病的防治研究［J］．广东林业科技，2007，23(2):42-45．

［8］ 信珊珊，祁高富，朱发银，等．1株解淀粉芽胞杆菌发酵条件的优化及其对油茶炭疽病的防效［J］．华中农业大学学报，2011，30(4):411-415．

［9］ 宋光桃，周国英．拮抗链霉菌F10抗油茶炭疽病菌抑菌机理的研究［J］．中南林业科技大学学报，2012，32(8):90-93．

［10］布婷婷，周国英，刘君昂，等．油茶内生细菌Y13对油茶抗性相关酶的诱导作用［J］．植物保护学报，2012，39(3):285-286．

［11］高月庭，周国英，何小勇，等．拮抗细菌Y13对油茶炭疽病防治试验［J］．浙江林业科技，2014，34(2):14-17．

［12］ 赵新海，钟丽娟，徐冲，等．康地蕾得对黄瓜枯萎病的室内毒力测定及田间防效试验［J］．农药，2008，47(9):696-698．

［13］ 魏鸿刚，李淑兰．防治作物青枯病和枯萎病的微生物农药—0．1亿cfu/g多粘类芽胞杆菌细粒剂［J］．世界农药，2008，30(1):52-53．

［14］ 郭芳芳，谢镇，卢鹏，等．一株多粘类芽胞杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定［J］．中国生物防治学报，2014，30(4):489-496．

［15］马桂珍，付泓润，王淑芳，等．海洋多粘类芽胞杆菌L1-9菌株发酵液抗菌谱及稳定性测定［J］．海洋通报，2013，32(3):316-320．

［16］ Ren Xiaoli，Zhang Nan，Cao Minghui，et al．Biological control of tobacco black shank and colonization of tobacco roots by a Paenibacillus polymyxa strain C5［J］．Biology and Fertility of Soils，2012，48(6):613-620．

［17］ SH Lee，YE Cho，SH Park，et al．An antibiotic fusaricidin:a cyclic depsipeptide from Paenibacillus polymyxa E681 induces systemic resistance against Phytophthora blight of red-pepper［J］．Phytoparasitica，2013，41(1):49-58．

［18］李小龙，王超，郭坚华．菌株518鉴定及其次生代谢产物的生防特性与分离［J］．浙江农业学报，2013，25(3):537-542．

［19］王春娟，郭亚辉，王超，等．根围促生细菌(PGPR)蜡质芽胞杆菌AR156对番茄的诱导耐旱性研究［J］．农业生物技术学报，2012，20(10):1097-1105．

［20］ 胡飞，周子燕，李昌春，等．多黏芽胞杆菌液态发酵条件的初步研究［J］．安徽农业科学，2011，39(12):7040-7042．

［21］张翼，白晨，冉国华，等．柑橘内生细菌YS45的鉴定、抗菌物质分析及其对油菜菌核病的防治作用［J］．植物病理学报，2009，39(6):638-645．

［22］方中达．植病研究方法［M］．北京:中国农业出版社，1998:152-155．

［23］王刘庆，王秋影，廖美德．多粘类芽胞杆菌生物特性及其机理研究进展［J］．中国农学通报，2013，29(11):158-163．

［24］王瑞芹，周国英，刘君昂，等．油茶内生拮抗细菌Y13的定殖能力及其对土著细菌的影响［J］．生物技术通报，2014(6):162-167．

［25］孟庆敏，周国英，刘君昂，等．油茶炭疽病拮抗细菌Y13主要抑菌物质分离纯化及作用方式［J］．植物保护，2014，40(2):36-42．