刘佳蕙，苏 敏，孙可欣，董益阳

镉系量子点的细胞毒性
——镉离子之辩

刘佳蕙，苏 敏，孙可欣，董益阳

(北京化工大学生命科学与技术学院，北京市生物加工过程重点实验室，北京 100029)

量子点是一种具有卓越荧光性能的新型纳米材料，在生物医学领域具有广泛的应用前景，故其生物安全性引起了人们的广泛关注.本文阐述了镉系量子点的细胞毒性机制的相关研究进展，重点关注镉离子的释放在镉系量子点的细胞毒性发挥的作用，以及相关的研究方法.

量子点；细胞毒性；镉离子

众所周知，镉是一种有着较高生物毒性的重金属元素.1971年，因镉造成的“痛痛病”极端残酷，使得当年的国际环境会议，将镉列为环境污染中最为危险的五大因素之一.我国的镉生产总量居全世界之首，“2012年广西龙江镉污染”、“2013年广州大米抽检，超四成镉超标”等事件接连报道，成为我国民众健康的巨大的威胁.

量子点(quantum dot，QD)由于优越的光学性能和纳米材料本身的诸多优势，在生物医学领域，特别是生物标记和活体成像方面得到了广泛应用.CdSe，CdTe为基础的量子点因为光学性质优异、合成方法成熟而被广泛研究和普遍应用.经过表面修饰后的两种QDs可用于细胞和活体动物的荧光成像.QDs在细胞内的标记效率也可达到与传统有机染料相当水平，并与大部分有机染料的短期细胞毒性程度相当[1].

量子点合成方法的改进和生物功能化修饰都极大的扩展了QDs的生物医学应用范围.QDs已经逐渐从实验室研究逐渐开始走向临床.然而，基于沉痛的历史教训，镉系的量子点在生物医学使用上的安全问题，一直以来受到广泛关注[2].QDs的生物安全性与其组成和表面性质相关，不同的QDs表现出的细胞毒性水平存在巨大差异.镉离子能否在生物体系内从QDs表面释放，QDs的细胞毒性机理与Cd离子的释放是否直接相关等问题，一直以来是人们研究和争议的焦点.本综述着重关注各种镉系QDs的细胞毒性是否与Cd离子的释放相关，并探讨Cd离子释放有关的影响因素.本文总结了研究QDs细胞毒性机制可以采用的实验手段，归纳了降低Cd离子从QDs上释放的方法，进而探索减轻QDs细胞毒性的方法.

2 镉系量子点的细胞毒性机制

2.1 镉释放引起镉系量子点的细胞毒性

镉离子是一种具有生物毒性的重金属元素，它可通过干扰DNA复制、取代蛋白质锌指结构中的Zn原子或产生活性氧自由基ROS等引发细胞死亡[3-4].有些研究发现，镉系QDs长期暴露在机体内，少量的镉离子被释放出来，释放的速度与时间、浓度、环境pH、QDs的种类等因素相关.长时间的环境暴露甚至可能引起QDs的崩解[5].此外，镉离子还有可能在制备QDs的过程中，被紧密吸附在QDs表面，在进入生物体后缓慢释放(图1)[6].由于镉离子明确具有较高的生物毒性，因而很多研究者认为镉离子的释放是QDs产生细胞毒性不可忽视的原因之一.

图1 镉系QDs的镉离子在细胞内的释放引起细胞毒性[6]Fig.1 The releasing of cadmium ions from the QDs in cells causes cytotoxicity[6]

Lovric等通MTT实验发现发红色荧光的CdTe量子点可以使鼠嗜铬细胞瘤细胞株12(PC-12)的细胞活性下降[7-8].量子点释放的Cd2+进入细胞后，会产生ROS增加氧化压力，在细胞中，Cd2+能置换出细胞质和细胞膜上的铁和铜，后两者可以通过Fenton反应参与氧化压力的形成[9].胞内氧化压力过高的直接后果是脂质过氧化，引起细胞膜或线粒体膜的破坏，导致细胞凋亡[10].Cd2+通过与蛋白质内巯基的相互作用使线粒体蛋白失活.Cd2+还可以与DNA直接作用，如与DNA分子中的磷酸、碱基等结合[11]，对机体具有极大的危害性.

基于Cd释放是镉系量子点产生细胞毒性的主要原因的理论，一些研究者开始利用核壳保护结构防止Cd离子从QDs中逃逸而降低其细胞毒性.ZnS壳的包裹能有效的阻碍Cd离子从QD表面的释放，进而降低QDs的细胞毒性[12-13].进一步，还可通过PMA (聚甲基丙烯酸)等高分子对QDs的表面包裹，使大部分Cd不从QDs上释放出来.在Soene等的研究中，PMA-QDs的总Cd浓度为1.32μM时，细胞内的自由Cd离子仅为10 nM[14].当保护基团过小，形成的保护壳过薄时，尽管可能在中性条件下降低Cd离子从QDs中的释放，但QDs进入细胞后，在溶酶体等细胞器中的酸性升高，Cd离子从QDs上解离的速度显著提高，而引发较高的细胞毒性(图2)[15].

然而，尽管有诸多证据证明Cd释放是引起镉系量子点的细胞毒性的主要原因.越来越多的研究也发现，镉系量子点的细胞毒性也有可能来自其他途径. Soene等通过细致的定量研究发现，在引起相同细胞毒性时，QDs和CdCl2相比，后者使细胞内Cd离子浓度的升高更为显著.这说明，QDs表面释放Cd离子不是QDs产生细胞毒性的主要原因.当然这不排除QDs释放Cd离子，使细胞内局域Cd离子浓度升高、QDs表面富集黏附的Cd离子等导致的高细胞毒性的产生[16].Hoshino等也认为CdSe/ZnS量子点的细胞毒性不主要由Cd离子的释放引起，而是由颗粒表面与细胞的相互作用引起的[17].

2.2 ROS引起镉系量子点的细胞毒性

ROS自由基的产生是量子点细胞毒性的重要机制之一.纳米材料由于量子限域效应和局部缺陷能够造成局部的活性较高，在环境的作用下，产生ROS.然而Cd离子也能引起细胞内ROS的升高.尽管Cd离子不是Fenton金属，不能直接催化ROS的产生，Cd离子可置换出蛋白中的Fe、Cu等金属离子，提高细胞内这些离子的含量，进而引起ROS的升高[18].Hsieh等人发现，CdSe/ZnS量子点可使BALB/3T3细胞溶酶体被破坏，ROS上升，产生氧化损伤[19].在李晓明等的研究中发现水相合成的量子点也会导致细胞基因表达水平的变化和 ROS的上升，但是并不引发细胞凋亡.通过比对CdTe量子点处理过的HEK293细胞的全基因表达谱发现有31个基因的表达水平上调，3个基因的转录水平下调.在上调的基因中，有17个是与蛋白结合、离子结合和细胞内氧化还原作用等细胞保护机制相关的[20].

图2 QDs在溶酶体内的分布和解离[15]Fig.2 The distribution and dissociation of QDs in the lysosome[15]

Nagy等则认为QDs的细胞毒性是否主要由Cd离子的释放引起，与QDs的表面化学性质有关.当QDs表面为负电荷(MPA，巯基乙酸)时，Cd离子在缓冲溶液中释放Cd离子的速度高于表面为正电荷(CTST，半胱胺)的QDs，负电荷的QDs的细胞毒性主要由Cd离子的释放引起.正电荷的QDs，虽然Cd离子的释放量低，却有着更高的细胞毒性，并能引起细胞内DNA的损伤.他们推测正电荷的QDs的细胞毒性主要不是由Cd离子的释放引起，而是由纳米材料引发的ROS导致[21].

3 判断镉离子是否是镉系量子毒性产生机制的方法

3.1 镉离子对照法

在镉系量子点的毒性实验中，经常设置CdCl2为对照组，观察QDs组引发的细胞的变化与CdCl2组在剂量和响应指标上是否一致，如果一致，则推测Cd离子的释放是QDs产生细胞毒性的可能因素[22].例如，Luo等在研究中发现，CdSe/ZnSQDs能够诱导小鼠肾肿瘤细胞RAG细胞发生自噬，而等浓度的CdCl2不能引发细胞的自噬，因而他们推测，Cd2+的释放不是QDs引起细胞发生自噬的主要原因[23].Nguyen等发现CdTe QDs和CdCl2都能引起细胞凋亡，且引起细胞凋亡路径相关的蛋白如Fas、caspase-8、Bcl-2、Bax、MAPKs、JNK、p38等的表达量的变化趋势一致.因而，他们认为Cd离子的释放是CdTe在HepG2细胞中产生毒性的主要原因之一[22].利这种镉离子对照法的优点是不需要对QDs进行改造，也不需要引入其他检测试剂，比较简便易行.因而成为QDs机制研究中的常用方法.

然而镉离子对照法也有不少缺点.首先，合理的CdCl2浓度难以选择.由于QDs是纳米颗粒，CdCl2是自由离子，二者进细胞的效率和途径不同，因而如果暴露于相同Cd当量下的两种物质，在细胞内的浓度不一致.即使通过改变暴露浓度，使细胞内的浓度一致，在细胞内的分布也可能不同.其次，Cd离子作为重金属离子，在细胞毒理学上的检测没有特异性的指标，能引起ROS，以及ROS下游的一系列毒理学变化，很难与纳米材料本身产生ROS的机制相区分.例如，一定浓度的镉离子和ROS都能够使细胞发生凋亡[24].而从是否发生凋亡的角度，无法判断量子点产生毒性是否源于解离出的镉离子.另外，在Bruneau等人的研究中，同一种QDs和Cd离子的免疫毒性还表现出了物种差异[25].

3.2 保护基团隔离对照法

通过某些生物相容性强的高分子、无机Si、Ti层的保护等，能够减少QDs向环境中Cd离子的释放.通过比较保护前后QDs毒性的变化，可以推测出Cd离子的释放是否是QDs产生细胞毒性的因素.这种方法较好的比较了QDs在Cd释放量变化前后的毒性的差异.Pisanello等将 QDs包埋在聚甲基硅氧烷(PDMS)中，极大的降低了Cd离子的释放[26].Gong等将QDs包埋在聚乳酸(PLA)中，也得到了细胞毒性很低的复合QDs材料[27].然而，纳米材料的毒性与其表面性质息息相关.不同表面基团、不同电荷密度的纳米材料的细胞毒性存在显著差异，这些隔离Cd离子的纳米壳在隔离Cd离子的同时，也使QDs的表面结构、组成、性质发生重大的变化，因而，也不是单一变量的减少了细胞内自由Cd离子的浓度.不过，在对QDs的表面隔离保护的研究中，可以获得多种不同表面结构且细胞毒性较小的QDs，这将利于QDs及纳米材料在生物医药领域的发展.

Cd离子引发的细胞毒性机制中，比较特征的是对金属硫蛋白家族(MT，methallothionein)含量的影响.研究发现MT的多个基因在QDs处理的实验组中均表达上调.MT蛋白的主要功能涉及调节细胞和机体内Zn的水平和分布等，由于具有合适的空间和配位基团，能够与Cu、Cd等多种重金属离子结合，保护细胞免受有毒金属和氧化应激诱导药物的损伤.Silva等人，通过提高CdSe量子点制备时Se的含量，降低CdSe表面Cd的百分含量，使孵育后的细胞内因Cd离子产生的MT蛋白的mRNA的上升减少，降低了QDs的细胞毒性[28].对MT含量变化的检测，能比较有力的证明Cd离子是否是镉系量子点引发细胞毒性的重要原因(图3)[13].

3.3 细胞内自由镉离子探针法

细胞内自由Cd离子浓度可以用探针测定(Measure-it kits，Molecular Probe，Invitrogen).若细胞内自由Cd离子浓度显著升高，则可判定QDs在细胞内一定发生了Cd离子的解离.此外，根据荧光强度，还能实现细胞内Cd离子浓度的定量分析.将孵育的细胞消化酶解，还能利用探针法测算细胞内总Cd离子浓度[14].

3.4 仪器法

原子吸收[18，29]、ICP-MS[30]通过测定细胞内Cd原子的变化量，能够精确的定量细胞内的总Cd含量.是探讨Cd离子是否是QDs产生细胞毒性的主要原因的重要方法.此外这些方法还可与色谱如μHPLC (微高效液相色谱)、SEC(体积排阻色谱)等方法联用，测定 Cd在细胞内与蛋白尤其是金属硫蛋白(MTs)结合的程度[18].

图3 镉系量子点释镉离子影响MT蛋白的表达[13]Fig.3 Releasing of cadium ions from cadmium containing quantum dots affects MT protein's expression[13]

4 总结与展望

目前关于镉系量子点毒性机制集中在Cd释放和ROS两大机制的辨析上.因量子点组成元素的多样性、合成方法的不同和功能化基团的差异，镉系量子点的细胞毒性究竟主要通过哪一种途径产生细胞毒性与量子点本身的组成、表面结构等性质相关.在实验中，可以采用Cd离子对照法，保护基隔离法、离子探针和仪器分析等方法来判断Cd释放是否是镉系量子点产生细胞毒性的主要因素.在判断过程中，金属硫蛋白表达和含量的变化是Cd离子相关的重要指标.

为了使量子点更好地应用于生物学和生物医学等领域，我们还需要对Cd离子是否是其细胞毒性产生的原因进行深入的探讨.还有待深入研究的课题包括:那些在短时间内处于安全水平或没有观测到Cd离子释放的镉系量子点，是否会在长期暴露的条件下在生物体内Cd离子的富集而产生较高的毒性；由于Cd离子机制和ROS机制在下游存在很多重合，对Cd离子细胞毒性产生的特征性机制还有待深入研究；开发能进一步降低量子点细胞毒性且具有优异光学特性的量子点也是该领域的重要课题.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Cytotoxicity of cadm ium-containing quantum dots
——debate on releasing cadm ium ions to induce cytotoxicity

LIU Jia-Hui，SU M in，SUN Ke-Xin，DONG Yi-yang

(School of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing Key Laboratory of Bioprocess，Beijing 100029，P.R.C.)

Quantum dot is a new kind of nanomaterialwith excellentfluorescence properties，which has been widely used in biomedical fields，and its biological safety has attracted widespread attention.This review describes themechanism of cytotoxicity of cadmium-containing quantum dots，and focuses on the results and methods for researching whether the release of cadm ium ions plays a key role to the cytotoxicity of cadmium-containing quantum dots.

quantum dot；cytotoxicity；cadm ium

R318.08；R99

A

2095-4271(2015)03-0310-06

10.11920/xnmdzk.2015.03.009

2015-03-15

刘佳蕙(1985-)，女，汉族，黑龙江海林市人，副教授，博士，主要从事纳米材料安全性及生物应用研究；E-mail:jhliu＠mail.buct.edu.cn.

董益阳(1967-)，男，汉族，安徽霍山县人，教授，博士，主要从事生命科学前沿相关技术与先进材料研究；E-mail: yydong＠mail.buct.edu.cn.

国家自然科学基青年基金(21301015)和中央高校基本科研业务费专项(YS1407)