南星梅，顾健

(西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041)

藏药五味沙棘口服液对实验性慢性支气管炎大鼠模型的防治作用研究

南星梅，顾健

(西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041)

为观察五味沙棘口服液对实验性慢性支气管炎动物模型的防治作用，初步探讨其作用机制，采用改良烟熏法复制大鼠慢性支气管炎模型，分为7组，按设计剂量分别灌胃给药，连续21d，末次给药后第2d取样，测定各组大鼠血清、肺组织及支气管肺泡灌洗液(BALF)中内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-8)、丙二醛(MDA)的含量.取部分肺组织进行病理学观察.结果显示模型组大鼠血清、肺组织及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量均较正常组明显升高(P＜0.01)，NO含量则明显低于正常对照组(P＜0.01).治疗组(除五味沙棘口服液低剂量组)大鼠血清、肺组织及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量较模型组明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，NO含量则明显高于模型组(P＜0.01或P＜0.05)，改善肺组织病理损伤.藏药五味沙棘口服液在一定程度上可治疗慢性支气管炎，且对肺组织具有一定的保护性.其作用机制可能与它增强肺组织自由基清除能力、改善机体功能状态、抑制炎性细胞因子的释放有关.

五味沙棘口服液；慢性支气管炎；TNF-α；IL-8；ET-1；MDA

慢性支气管炎(下文中统称为:“慢支”)是临床常见病、多发病.严重危害患者身心健康，当今五味沙棘散作为对慢支具有明显药效的传统藏药，具有非常广泛的应用.

对其进行研究和开发为一种有效的防治慢支药物新剂型是具有一定社会效益的.

现代研究中较少见对五味沙棘散的机型改革.本实验将辅以现代研究方法对传统藏药经典方防治慢支进行研究.观察五味沙棘口服液对以烟熏法复制的慢支症模型的SD大鼠中血清、肺组织匀浆及支气管肺泡灌洗液(BALF)中ET-1、NO、TNF-α、IL-8、MDA的影响，观察组织病理学，探索其对治疗慢性支气管炎可能的作用机制.

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠42只，体重220±20 g，购于成都达硕实验动物研究中心.许可证号:SCXK(川2013-24).

1.2 药物

五味沙棘口服液由沙棘36 g、广木香30 g、甘草18 g、栀子12 g、白葡萄干24 g，采用水提醇沉法，制成口服液(实验室自制).川贝枇杷糖浆，江西远东药业有限公司，批号20131105；五味沙棘散，内蒙古蒙药股份有限公司，批号130951，以上生药材药物广木香、白葡萄干、栀子、甘草购自成都荷花池中药材市场，沙棘购自内蒙古，经西南民族大学顾健教授鉴定，所有以上药材及饮片经检验均符合《中国药典》2010版的规定.

2 实验方法

2.1 大鼠慢支模型的复制

参照《医学动物实验方法》，SD大鼠在实验室室温ll℃-l7℃的环境中饲养一周后，除正常对照组的6只大鼠于正常的无烟环境中饲养外，将其余36只需要造模的大鼠置于特制烟室中，点燃用刨花、锯末、烟叶各50g制成的烟条进行烟熏，每天2次，每次30 min，每次间隔4h.持续30d.造模结束后，大鼠的气道呈现典型组织病理学改变，包括明显支气管黏膜上皮纤毛的倒状，上皮脱落或形成溃疡、管腔分泌物增多、炎症细胞浸润、环状细胞增生、管壁增厚.[2]其组织病理学改变与文献报道相近，表明慢支模型复制成功.

2.2 实验分组

将造模组大鼠36只在模型复制成功以后，随机进行分组:模型组、五味沙棘口服液高、中、低剂量组、川贝枇杷糖浆对照组、五味沙棘散组.及不加处理的空白组，每组6只.

2.3 给药

于造模结束后第2 d起，用生理盐水10mL/kg对正常组和模型组进行灌胃；五味沙棘口服液高剂量组(1.8 g/kg)、中剂量组(1.35 g/kg)、低剂量组(0.9 g/ kg)每日灌胃给药治疗；川贝对照组，每日用药剂量为0.9 g/kg；购买五味沙棘散组，每日用药剂量1.8 g/ kg.以上7组均每日1次灌胃，持续灌胃21 d.

2.4 样本制备

灌药3 w后的第2 d，采用腹主动脉取血，血样于离心机中以4000 r/min离心5 min并分离血清.

将新分离出的约0.5 g左右的肺组织用冰生理盐水冲洗去除表面血渍后，滤纸吸湿，放入手动匀浆器加冰生理盐水后研磨，制成10%的匀浆.立即于低温离心机中以6000 r/min下离心5min，并吸取上清液.

取右侧肺组织先用生理盐水洗去表面血渍，用细线固定灌胃针头于气管处，用针管吸取4℃生理盐水4 mL，反复灌洗4次，回收的灌洗液量＞90%，立即于低温离心机中以1500 r/min下离心5 min，吸取上清液.

所有以上制备的样本，都在制样结束后立刻测定蛋白含量(双缩脲法)，余液-20℃冻存待检.按试剂盒测定说明书分别测定三种样本中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA、NO五项指标.

取部分左肺组织用10%甲醛溶液固定，HE染色，光镜下观察病理形态学.

2.5 指标检测与统计方法

采用酶联免疫法测定:TNF-α、IL-8、ET-1，MDA、NO严格按试剂盒说明书检测.实验结果用平均值±标准差(±s)表示，采用方差分析和q检验.应用SPSS统计软件统计分析.

3 结果与分析

3.1 各组大鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA、NO含量变化

采用改良烟熏法复制的慢性支气管炎大鼠血清、肺组织及BALF中的TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量均较正常对照组明显升高(P＜0.01)，NO含量则明显低于正常对照组(P＜0.01).治疗组(除五味沙棘口服液低剂量组)大鼠血清、肺组织及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量较模型组明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，NO含量则明显高于模型组(P＜0.01或P＜0.05)，改善肺组织病理损伤.结果见表1-表5.

表1 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎NO含量的影响(±s，n＝6)Table1 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the NO content in rat chronic bronchitis

表1 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎NO含量的影响(±s，n＝6)Table1 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the NO content in rat chronic bronchitis

注:与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与空白组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 剂量/g·kg-1 组织/pg·mL-1 血清/pg·mL-1 BALF/pg·m L-1空白组 — 10.03±0.28 489.85±19.17 94.05±13.46模型组 — 6.72±0.914) 351.38±16.584) 66.87±11.624)中药阳性组 0.9 8.59±0.742) 408.63±38.241) 83.53±12.38五味沙棘散组 0.9 7.97±0.59 428.36±18.752) 84.53±10.582)五味沙棘口服液高 1.8 7.77±0.791) 446.22±44.841) 88.15±22.332)中1.35 7.99±0.69 438.36±33.75 79.73±12.361)低0.9 7.21±1.01 422.20±36.20 74.85±17.24

表2 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎MDA含量的影响(±s，n＝6)Table2 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the MDA content in rat chronic bronchitis

表2 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎MDA含量的影响(±s，n＝6)Table2 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the MDA content in rat chronic bronchitis

注:与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与空白组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 剂量/g·kg-1 组织/nmol·mL-1 血清/nmol·m L-1 BALF/nmol·m L-1空白组 — 3.33±0.48 329.85±13.46 5.42±1.94模型组 — 4.68±0.614) 391.38±14.884) 7.68±1.994)中药阳性组 0.9 4.19±0.872) 348.63±28.541) 5.64±1.011)五味沙棘散组 0.9 3.78±0.421) 372.63±15.441) 5.84±1.231)五味沙棘口服液高 1.8 3.58±0.591) 366.22±46.841) 5.97±1.281)中1.35 3.87±0.63 378.36±23.851) 5.77±1.831)低0.9 3.91±1.06 382.20±15.73 6.62±1.35

表3 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎ET-1含量的影响(±s，n＝6)Table3 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the ET-1 content in rat chronic bronchitis

表3 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎ET-1含量的影响(±s，n＝6)Table3 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the ET-1 content in rat chronic bronchitis

注:与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与空白组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 剂量/g·kg-1 组织/pg·mL-1 血清/pg·mL-1 BALF pg·mL-1空白组 — 7.02±0.41 122.35±10.28 3.44±1.64模型组 — 13.24±2.344) 199.64±12.534) 8.45±1.244)中药阳性组 0.9 10.34±1.47 157.63±22.371) 5.46±1.211)五味沙棘散组 1.8 6.73±1.842) 172.24±17.841) 5.26±1.361)五味沙棘口服液高 1.8 5.48±1.562) 156.22±31.841) 5.15±1.411)中1.35 7.37±1.631) 169.92±21.841) 5.97±1.471)低0.9 8.68±2.05 182.20±13.63 6.12±1.26

表4 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎IL-8含量的影响(±s，n＝6)Table 4 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the IL-8 content in rat chronic bronchitis

表4 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎IL-8含量的影响(±s，n＝6)Table 4 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the IL-8 content in rat chronic bronchitis

注:与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与空白组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 剂量/g·kg-1 组织/pg·mL-1 血清/pg·mL-1 BALF pg·mL-1空白组 — 326.69±26.47 1234.64±48.79 440.46±38.34模型组 — 683.54±54.644) 3584.33±39.574) 807.45±32.754)中药阳性组 0.9 434.57±25.462) 1566.34±46.471) 530.74±42.351)五味沙棘散组 1.8 436.34±31.361) 2587.27±46.641) 530.36±46.861)五味沙棘口服液高 1.8 389.26±24.781) 1866.86±56.891) 486.56±57.341)中1.35 437.64±15.46 2579.47±35.681) 480.99±45.351)低0.9 543.68±27.89 3478.87±46.97 669.37±54.34

表5 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎TNF-α含量的影响(±s，n＝6)Table5 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the TNF-αcontent in rat chronic bronchitis

表5 五味沙棘口服液对大鼠慢性支气管炎TNF-α含量的影响(±s，n＝6)Table5 The Impact of Wuwei Shaji oral liquids on the TNF-αcontent in rat chronic bronchitis

注:与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01；与空白组比较，3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 剂量/g·kg-1 组织/pg·m L-1 血清/pg·mL-1 BALF pg·mL-1空白组 — 20.69±3.64 329.85±58.45 40.47±3.99模型组 — 45.62±4.624) 3835.36±79.564) 80.25±3.574)中药阳性组 0.9 34.30±5.372) 1686.34±48.961) 50.35±4.471)五味沙棘散组 1.8 33.28±3.751) 2347.63±78.451) 53.57±4.251)五味沙棘口服液高 1.8 27.94±4.291) 1746.86±96.451) 46.48±4.171)中1.35 37.59±5.92 2399.47±73.261) 49.59±4.681)低0.9 42.91±4.07 3345.87±97.34 69.62±5.31

3.2 病理形态学改变

表6 肺组织病理改变评分Table6 Lung histopathology score

光镜下观察:空白对照组:支气管粘膜上皮细胞完整，细胞排列整齐，支气管管壁及肺泡无明显的病理学改变(如图1A).模型组:支气管管壁大量纤维组织增生，且明显可见其管壁有明显的增厚，支气管粘膜上皮细胞大量脱落，且有杯装的细胞增生，支气管周围可见大量以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润，肺泡上皮细胞有部分坏死脱落，肺泡间隔变大，小静脉有淤血的现象(如图1B).川贝对照组:支气管粘膜上皮细胞较为完整，支气管周围也没有明显的炎细胞浸润，肺间隔没有充血水肿，仅见支气管管壁增厚和纤维组织的增生(如图1C).五味沙棘散组:支气管管壁纤维组织有增生，且管壁增厚，支气管周围可见大量以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润，肺泡间隔有一定程度的充血水肿，小静脉有淤血的现象(如图1D).五味沙棘口服液低剂量组:支气管粘膜上皮细胞有损伤和脱落，支气管管壁纤维组织有明显的增生和管壁的增厚，支气管周围炎性细胞浸润.肺间隔增宽(如图1E).五味沙棘口服液中剂量组:支气管粘膜上皮细胞较为完整，但伴可以看出支气管管壁纤维组织有一定的增生和管壁的增厚现象，同时伴有炎性细胞浸润.肺间隔增大(如图1F).五味沙棘口服液高剂量组:支气管粘膜上皮细胞完整，未见有明显的细胞水肿，支气管管壁也未见明显的增厚，仅有少量的淋巴细胞浸润的现象(如图1G).

图1 肺组织病理切片图Fig.1 Lung tissue pathological sectionsA:空白正常(Blank group)；B:模型(Model group)；C:川贝对照组(Chuanbei pipa syrup group)；D:五味沙棘散(Wuwei Shaji San group)；E:低剂量组(Low-dose group)；F:中剂量组(Middle dose group)；G:高剂量组(High-dose group)；

4 讨论

采用改良烟熏法复制的慢性支气管炎模型构建成功；本实验中模型组大鼠血清、肺组织及BALF中TNF-α、IL-8、ET-1、MDA含量均较正常组明显升高，NO含量则明显低于正常对照组，经过给药，发现五味沙棘口服液高、中剂量可以明显降低MDA含量，提示①五味沙棘口服液具有抗脂质过氧化作用，并通过该作用减轻脂质过氧化产物对肺组织和支气管的损伤.②ET-l含量低于模型组，说明经治疗后ET-1的释放受到抑制，从而减轻气道的炎症反应和组织损伤.③NO含量高于模型组，显示出治疗各组药物均能提高NO的含量，从而恢复肺部血管、支气管平滑肌正常的舒张状态，控制肺部慢性炎症，改善机体功能状态.④炎症细胞因子TNF-α、IL-8的合成与释放的增多对慢性支气管炎的形成有重要影响，经治疗给药后，TNF-α、IL-8含量较模型组具有明显的降低，这可能证明五味沙棘口服液抑制了巨噬细胞和中性粒细胞的趋化和激活，减少了炎症物质的释放，从而减轻和控制炎症反应有关，防止其对机体组织的进一步损害.同时，有病理切片可知，经治疗用药，五味沙棘口服液高剂量组较低、中剂量组与川贝对照组、五味沙棘散组能显著改善慢支大鼠支气管、肺组织损伤程度，表现为:用药后气管粘膜上皮细胞完整，未见有明显的细胞水肿，支气管管壁也未见明显的增厚，仅有少量的淋巴细胞浸润的现象.上述实验结果表明，藏药五味沙棘口服液对慢性支气管炎及肺组织具有一定的保护作用，该作用可能与药物抗肺组织自由基损伤，增强机体自由基清除能力，抑制炎性细胞因子释放等多途径共同作用相关.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Preventive and curative effects of Wuwei Shaji oral liquid on chronic bronchitis

NAN Xing-mei，GU Jian

(Institute of National Medicine，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

To observe themechanism of Wuwei Shaji oral liquid on treating experimental chronic bronchitis，this paper duplicated the animalmodel of chronic bronchitis using refined smoking-fumigated method.The rats were allocated to 7 groups and administrated with designed agents and dose by gavage for21 days.On the second day after the last dose，sampleswere collected formeasuring the ET-1，NO，TNF-α，IL-8 and MDA contents in the serum，lung homogenate and BALF of each group and observing histopathology changes of lung tissue.The ET-1，TNF-α，IL-8 and MDA levels in the serum，lung tissue and BALF inmodel group are significantly higher than those in normal group(P＜0.01)，while the NO content is significantly lower than that in normal group(P＜0.01).The TNF-α，IL-8，ET-1，MDA contents in the serum，lung tissue and BALF in treatmentgroups(except for low dose Wuwei Shaji oral liquid group)were significantly reduced(P＜0.05 or P＜0.01)，the NO content is significantly increased，compared with the normal group(P＜0.05 or P＜0.01)，and the injured pulmonary tissuewas improved.To some extent，Wuwei Shaji oral liquid could treat chronic bronchitis and protect pulmonary tissue，and themechanism may be related to the enhancement of radical scavenging capacity，improvement on functional status of body，and inhibition of inflammatory cytokine release.

Wuwei Shaji oral liquid；chronic bronchitis；TNF-α；IL-8；ET-1；MDA

R285；R29

A

2095-4271(2015)03-0299-06

10.11920/xnmdzk.2015.03.007

2014-12-02

顾健(1967-)，男，汉族，浙江武义人，教授，博士研究生导师，研究方向:中药及民族药物研究开发；E-mail:gujian_3＠163.com.

四川省科技支撑计划项目(2013SZ0124)；研究生“创新型科研项目”(CX2014SZ52)