李冰洁(抚顺市卫生学校检验教研室，抚顺 113008)

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是世界范围内流行的儿童常见病，可由多种病毒感染引起，以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在发病后5-7 d内痊愈，属于自限性疾病，但有时候，尤其是人肠道病毒71型(human enterovirus 71，HEV71)感染5岁以下的儿童导致HFMD时，会出现比较严重的并发症，包括心肺并发症(如急性神经源性肺水肿、肺出血和心肌炎等)和神经系统并发症(如脑干脑炎、无菌性脑膜炎和类脊髓灰质炎样麻痹等)［1，2］，所以选择一种敏感的细胞系对肠道病毒EV71型进行快速准确分离及鉴定，不仅能为临床诊断提供辅助依据，同时能为制定降低儿童的重症和死亡率的防控措施提供有力的科学依据。

本研究采用三种不同的细胞对EV71核酸检测阳性的标本进行病毒分离，通过对比不同细胞的分离率来比较细胞的敏感性，从而确定肠道病毒EV71的敏感细胞，建立快速准确的病毒分离方法，为进一步对肠道病毒EV71进行变异分析打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒采样管:友康恒业生物科技(北京)有限公司生产。

细胞株:人喉癌上皮细胞(HEP-2)、非洲绿猴肾细胞(VERO)、人横纹肌肉瘤细胞(RD)三种细胞进行病毒分离，细胞均为本单位细胞库保存。

细胞培养液 MEM、胎牛血清:美国Gibco/BRL公司生产;青霉素、链霉素为东北制药厂生产。

核酸提取仪器:QIAGEN公司的EZ1 Advanced XL全自动核酸提取仪。核酸提取试剂盒:QIAGEN公司的 EZ1 Virus Mini Kit V2.0(Cat.No.955134)试剂盒。核酸检测试剂盒:江苏硕世公司肠道病毒EV71型检测试剂盒。荧光定量PCR仪:美国AB公司的ABl7500型荧光定量PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集和处理 在2014-07～2014-08期间于抚顺市中医院内科门诊采集20名症状典型、发病7 d内的临床诊断为HFMD的患者咽拭子标本，采集后立即投入装有病毒采样液的小试管中冷藏运输至实验室。标本一部分用于核酸提取并进行PCR检测，另一部分-70℃冰箱冻存用于病毒分离。

1.2.2 病毒分离鉴定 使用 HEP-2、VERO、RD三种细胞进行病毒分离，每种细胞接种500 μl标本，在35℃培养箱中培养7 d，每份标本在三种细胞上至少传三代，如果不出现致细胞病变效应(CPE)，则判为阴性;如果出现CPE，则使用荧光定量PCR(real time-PCR)方法进行肠道病毒EV71型型别鉴定。

1.2.3 病毒核酸提取 将HFMD患者的咽拭子标本及经过细胞培养的有CPE的病毒液提取核酸，所提取的核酸为 RNA。实验采用 QIAGEN公司的EZ1 Advanced XL全自动核酸提取仪，使用EZ1 Vi-rus Mini Kit V2.0(Cat.No.955134)进行核酸提取，具体步骤参考说明书。

1.2.4 病毒核酸检测 将所提取的核酸应用real time-PCR检测方法进行检测，使用的试剂盒是江苏硕世公司肠道病毒EV71型检测试剂盒，扩增反应体系和条件按照说明书操作和设置，在ABl7500型荧光定量PCR仪上进行操作。

2 结果

2.1 标本的核酸检测结果

对所采集的20份标本进行肠道病毒EV71型检测，检测结果见图1。

图1 20份标本的real time-PCR检测结果Figure 1 Real-time PCR amplification results of 20 cases of hand，foot and mouth disease

如图1 所示，共有10条典型的阳性曲线，其中1条为阳性对照，其余9条为阳性标本，这9份标本的CT值小于35，可以确定为EV71阳性。通过核酸检测，在所收集的20份标本中，有9份标本核酸检测阳性，可以认为其阳性检出率为45%(9/20)。

2.2 病毒分离

选用人喉癌上皮细胞(HEP-2)、非洲绿猴肾细胞(VERO)、人横纹肌肉瘤细胞(RD)三种细胞进行病毒分离，将所采集的9份阳性标本分别加入细胞中，每份标本在三种细胞上至少传三代，其中VERO细胞和RD细胞出现了细胞病变(CPE)，HEP-2没出现CPE。

9份阳性标本接种VERO细胞第二代后，其中8瓶细胞于48 h左右出现了明显的CPE，病变表现为细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串状(图2，见封3)。

9份阳性标本接种RD细胞第二代后，其中5瓶细胞于48 h左右出现了明显的CPE，病变表现为细胞皱缩、变圆脱落(图3，见封3)。

2.3 病毒培养液的核酸检测结果

我们在组织培养第三代时分别抽取Vero细胞和RD细胞的病毒培养液，进行real-time PCR实验，结果见图4。

如图4所示，共有15条典型的阳性曲线，其中1条为阳性对照，其余14条为阳性病毒培养液，这14份标本的CT值小于35，均在20左右，可以确定为EV71阳性病毒液。经检测，HEP-2细胞的病毒培养液，9份标本结果全部为阴性;RD细胞的病毒培养液，6份标本结果为阳性，3份标本结果为阴性;VERO细胞的病毒培养液，8份标本结果为阳性，1份标本结果为阴性。

3 讨论

肠道病毒是引起婴幼儿HFMD的病原，人类是其已知的唯一自然宿主，其中最主要的病原是EV71和CA16。与CA16相比，EV71感染更易侵犯神经系统导致中枢神经性心肺衰竭而导致死亡［3］。我国于2008年5月把手足口病纳入法定传染病，从法律上严格规定了该病的报告与管理［4］。卫生部2010年的统计数据显示，在丙类传染病中，2009年HFMD报告发病数和报告死亡数均跃居第一位。HFMD已成为危害我国儿童健康的重要公共卫生问题。辽宁省与其他各省的情况一样，在2008年手足口病发病率是33.70/10万、2009年的发病率是84.79/10万，到2012年发病率为99.95/10万，发病率呈逐年上升的趋势。在病原构成上，基本上EV71、CA16和其他肠道病毒各占三分之一，但在重症及死亡病例的病原构成上，EV71占有绝对优势，所以由肠道病毒EV71引起的手足口病造成的危害是不容小觑的［5］。

图4 病毒培养液的real time PCR检测结果Figure 4 Real-time PCR amplification results of the cultured viruses fluid

尽管我们现在有许多快速诊断的方法，诸如荧光定量PCR、胶体金等等，但是细胞培养进行病毒分离是病原检测的金标准，可进行病毒分型和抗原变异分析［6］，所以在手足口病的疫情监测和研究中依然是不可替代的方法。本实验使用人喉癌上皮细胞(HEP-2)、非洲绿猴肾细胞(VERO)、人横纹肌肉瘤细胞(RD)三种细胞对肠道病毒EV71型进行分离，结果表明肠道病毒EV71型对VERO细胞的敏感性最高，其次是RD细胞，对HEP-2细胞不敏感，因此我们认为分离肠道病毒EV71型首选的细胞是VERO细胞。VERO细胞是一种传代细胞，其易培养、生长快，而且在有限的代次内无致肿瘤性，在国内已经被广泛应用于疫苗生产［7］;而肠道病毒EV71型在VERO细胞上病变明显，容易观察，这就为用VERO细胞生产肠道病毒EV71型疫苗提供了一种可能性。

近几年EV71疫苗研究取得了快速进展。从疫苗的紧急需求性、安全性等方面而言，灭活EV71疫苗是目前疫苗发展的主要类型，全球已有5株EV71灭活疫苗进入临床试验［8］，其中3株来自中国大陆的疫苗于2010年12月先后进入临床试验，目前均进入Ⅲ期临床试验。虽然临床试验显示灭活EV71疫苗有较好的免疫原性及安全性，但其保护效果仍有待继续评价。不仅如此，由其他肠道病毒引起的手足口病疫情也不容小觑，从全面控制手足口病的角度看，研制包括多种肠道病毒的联合疫苗将是手足口病疫苗的发展方向。

［1］McMinn PC.An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance［J］.FEMS Microbiol Rev，2002，26(1):91-107.

［2］Singh S，Poh CL，Chow VT.Complete sequence analyses of enterovirus 71 strains from fatal and non-fatal cases of the hand，foot and mouth disease outbreak in Singapore(2000)［J］.Microbiol Immunol，2002，46(11):801-808.

［3］Zhang Y，Zhu Z，Yang W，et al.An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of hand foot and mouth disease in Fuyang city of China［J］.Virol J，2010，7:94.

［4］于伟，姚文清，陈静乙.辽宁省2008年 -2009年肠道病毒EV71型VP1区基因特征分析［J］.中国卫生检验杂志，2011，21(4):987-992.

［5］王伶，田疆，于伟，等.2009-2013年辽宁省手足口病重症病例流行特征分析［J］.疾病检测，2014，29(8):624-628.

［6］陈健，李燕婷，王晔，等.胶体金法与病毒分离鉴定在流感诊断中的比较［J］.上海预防医学杂志，2008，20(12):573-574.

［7］于伟，刘云，姚文清，等.Vero细胞致肿瘤原性的分析［J］.中国公共卫生，2006，12(22):42-43.

［8］唐培，余楠，车小燕，等.肠道病毒71型疫苗研究的新进展［J］.广东医学，2014，35(8):1272-1274.