马力天，李 洁，张 毅，任秦有，丁井永，赵参军，杜江河，李 佩，毛立挺，郑 瑾(解放军68部队营卫生所，陇西 78000;第四军医大学唐都医院中医科暨中西医结合肿瘤科;解放军医院内分泌科;解放军68部队卫生队;解放军68部队卫生队;通讯作者，E-mail:zjddln@6.com)

肝纤维化(liver fibrosis，LF)是肝内结缔组织的异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，是许多慢性肝病发生发展过程中的重要特征，如肝细胞癌［1］和肝硬化［2］。多种原因可以导致LF的发生，如病毒感染、乙醇摄入、肝内脂肪沉积、糖尿病、毒物等［3，4］。肝纤维化的特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积。肝纤维化的发病机制非常复杂，目前主要认为肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活，转化为成肌纤维细胞和成纤维细胞［5-8］，合成分泌大量ECM在LF的发病过程中起了主要作用。肝纤维化是一种可逆的损伤修复反应［9］。HSC的激活是本病发展的中心环节，因此，主要在以下几个方面进行肝纤维化的治疗:①去除原发病因;②围绕HSC进行治疗，如通过抑制PDGF和TGF-β来抑制HSC的活化、直接抑制HSCs的活性和抑制ECM的合成和分泌等。但是由于肝纤维化发病原因极其复杂，西药在治疗方面效果并不理想且费用昂贵。而祖国医学在这方面有其独特的优势，不仅有价格优势，而且不良反应较少。

根据其临床表现，属于中医“积聚”等病症范畴，大量的研究表明［10-12］，中药在治疗本病方面有疗效好，且毒副作用小的优势。因此，我们选择中药复方益气活血方(Yiqihuoxue prescription)，以人肝星状细胞LX-2为靶细胞，用MTT法观察不同剂量药物对其增殖的影响，用流式细胞术观察药物对细胞凋亡的影响，体外研究其对LX-2细胞的抑制作用，为进一步研究其导致LX-2细胞凋亡的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MTT试剂(晶彩生物有限公司)、Bio-rad酶联免疫检测仪、DMEM高糖培养基(Gibco公司，美国)、四季青胎牛血清。LX-2细胞由第四军医大学细胞工程学研究中心边惠洁教授赠予，美国 Bection Dickinson公司流式细胞仪，750 g多功能粉碎机、渗滤柱、旋转蒸发仪、循环水式多用真空泵。

1.2 LX-2细胞的培养及传代

将LX-2细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞孵箱中，每天换液1次。在倒置显微镜下观察细胞密度为80%-90%时，以胰酶37℃消化2-3 min传代。

1.3 实验药物的制备

精选黄芪15 g、人参10 g等益气药物，莪术15 g、当归10 g等活血药物共17味中药组成复方益气活血方(购自西安市诚信药材行)。

制备过程:(1)提挥发油:①用750 g多功能粉碎机将益气血活血方中当归、莪术，过1号筛，直至全部粉碎完毕。②先将益气活血方中当归、莪术按1∶1的比例加入渗滤柱中，第1次加入1 500 ml的石油醚，以60滴/min的速度开始滴，直至滴完，然后再加入2次石油醚，每次500 ml，以同样的滴速滴完;③将渗滤出的石油醚+药油装入1 000 ml的烧瓶中，每次500 ml，用旋转蒸发仪进行蒸发，直至石油醚全部回收完成，将留下的挥发油装入玻璃瓶中，密闭备用;④将渗滤柱中的药粉倒出，使石油醚挥发完毕，干药粉保存备用。(2)熬药:每剂250 g加水500 ml，按传统煎药法文火煎煮30 min取药液，以恒温水浴锅浓缩成含生药1.25 g/ml的汤剂，真空包装，4℃冰箱保存。以上工作由第四军医大学唐都医院药剂科中药制作车间完成。

1.4 药物浓度的选择及稀释

一个60 kg的病人，其体液量占总重量的20%，即12 L，熬成的药物浓度为:1.25 g/ml，按照成年人每天服用50 ml计算，假定全部吸收，则其体内药物浓度为:(50 × 1.25)/12 000=5.21 mg/ml，但是药物不可能被全部吸收，所以在我们进行MTT实验时，选择药物浓度略低于5.21 mg/ml，因此选择的药物浓度为 1.125，2.228，3.31，4.37，5.41 mg/ml。在用流式细胞术检测细胞凋亡时，选择药物浓度为1.125，2.228，6.432 mg/ml。

由于1.25 g/ml的药物很黏稠，所以在加药时要进行稀释，其稀释方法为:将100 μl的益气活血药物溶于1 000 μl的培养基中(含10%FBS和双抗)，稀释后药物浓度为113.63 mg/ml。药物稀释后，用0.22 μm孔径的滤器对其进行过滤除菌。

1.5 MTT法检测LX-2细胞的增殖情况

对数生长期的LX-2细胞，胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)将细胞浓度调为5×104cell/ml细胞悬液后，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μl(即每孔5 000个细胞)，放在37℃、5%CO2的细胞培养箱中，待细胞贴壁长至底面积的50%后，更换培养基，并且每孔分别加入过滤后的益气活血药物，使终浓度达到1.125，2.228，3.31，4.37，5.41 mg/ml;每一浓度设 4个复孔，另设空白对照组，此外，设立单加药物和培养基，不加细胞的对照组(观察药物是否会与MTT反应)。单独作用24，48 h后，去除培养基，每孔加20 μl，5 mg/ml MTT 溶液，孵育 4 h，每孔加入二甲基亚砜150 μl，在微型混合器上振荡10 min后于全自动酶标仪上测定490 nm OD值。实验重复3次，取均值计算增殖抑制率。增殖抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

取对数生长期的LX-2细胞，胰酶消化后，常规离心，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)将细胞浓度调为5×104cell/ml细胞悬液后，接种于6孔培养板，每孔加细胞悬液2 000 μl，放在37℃、5%CO2的细胞培养箱中，待其长到80%后，更换培养基，并且每孔分别加入益气活血药，使终浓度达到1.125，2.228，6.432 mg/ml。药物作用 24 h 后，收集细胞(贴壁细胞用胰酶消化，悬浮细胞离心收集)，收集细胞后用PBS洗2次，根据AnnexinⅤ-FITC/PI双标记试剂盒说明，取195 μl细胞悬液，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC混匀，室温反应10 min，PBS洗细胞一次，在以190 μl稀释的结合缓冲液重悬，加10 μl的PI，用流式细胞仪分析。

1.7 统计学分析

图1 益气活血方对LX-2细胞增殖的影响Figure 1 Effect of Yiqihuoxue prescription on the proliferation of LX-2 cells

2 结果

2.1 益气活血方对LX-2细胞增殖的影响

各时间点各浓度药物对LX-2细胞的增殖均有抑制作用(P＜0.05，见图1)，24 h时随药物浓度增加，其抑制作用也逐渐增强(P＜0.05)，48 h时当药物浓度达到3.31 mg/ml时，其抑制作用不随药物浓度的增加而增强(P ＞0.05)。除 4.37，5.41 mg/ml外，其余组随药物作用时间的延长，其抑制率也增高(P ＜0.05)。

2.2 益气活血方对LX-2细胞凋亡的影响

细胞在接受到相应的信号刺激时会启动细胞凋亡，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)在细胞凋亡早期会从细胞膜内侧翻转到细胞膜的表面，AnnexinⅤ与PS高亲和力特异性结合，检测标记荧光的AnnexinⅤ可以识别细胞的早期凋亡。在细胞凋亡的中晚期和死细胞，碘化丙啶(propidine iodide，PI)能透过细胞膜而使细胞核红染。因此，联合使用AnnexinⅤ与PI，可以将早晚期凋亡细胞和死细胞区分开。

凋亡结果显示:细胞凋亡率(B2+B4)随药物浓度增加逐渐增加(见图2)，其中B4为早期凋亡，B2为晚期凋亡，即，益气活血方可促进细胞凋亡。

图2 益气活血方作用24 h对LX-2细胞凋亡的影响Figure 2 Apoptosis of LX-2 cells after treated with Yiqihuoxue prescription for 24 h

3 讨论

肝星状细胞(HSC)的激活、增殖在肝纤维化的发生发展中发挥着至关重要的作用［13，14］。西方医学针对本病无特效药，祖国医学却日益发挥出独有的优势。虽然在祖国医学中并无本病的具体病名，但可依据其临床表现将其病机归纳为“气滞血瘀”和“正气虚弱”，在治疗上当强调“活血化瘀”与“扶正补虚”并用［15，16］。中医学认为，肝体阴用阳，性喜调达，恶抑郁，主藏血，各种原因导致的肝气调达不畅，日久则必生淤血。“血为气之母”，“淤血不去则新血不生”，血瘀日久，会导致气生发无源，因此临床上，此类病人往往伴有低热、心烦等阴虚症状和少气懒言、乏力等气虚症状。目前，已经有大量的实验和临床研究证实中药对肝纤维化有着较好的疗效［17-20］。在本文中，我们使用益气活血方(黄芪、人参、莪术、当归、熟地、三棱、红景天等)，以人肝星状细胞LX-2为靶细胞，来观察该方剂对细胞凋亡和增殖的影响。当归，归肝经，重在引药至肝所。黄芪、人参能够大补元气，起到补气行血的功效，熟地、三棱、莪术、红景天连用，起到补血活血之功，余药与此配伍，能起到益气活血、凉血养阴之用，众药合用，共奏补肝之虚，养肝之阴，活肝之淤之功。

在药物制备方面，我们将熬好的药材稀释后经0.22 μm孔径的滤器对其进行过滤除菌直接作用于细胞，与含药血清的制备法相比，这样可以排除其他一些成分对实验的干扰，另外，这样可以为后期制备给方剂的注射液提供参考。

从MTT的结果(图1)中发现，益气活血方可明显抑制肝星状细胞LX-2细胞的增殖，当药物作用48 h时，浓度达到3.31 mg/ml以上时，其抑制作用不随药物浓度的增加而增强，这可能与加药时细胞数量、细胞密度、细胞状态有关，我们在其他的实验中发现(数据未在文中体现):初始细胞数量较多时，药物作用24 h和48 h后，其抑制率依然会随着药物浓度的增加而增加。不仅如此，我们还发现，当初始细胞数目较多时，低浓度(1.125，2.228 mg/ml)的MTT检测结果要高于空白对照组，但是随着药物作用时间的延长，其OD值逐渐降低。这可能是因为，我们的复方中黄芪、人参的含量较高，这种益气药本身可以增强人体抵御外邪的能力，根据中医“正邪相抗”的理论，当“正盛而邪不衰时”，正邪之间抗争剧烈，因此当低浓度的益气活血方作用于细胞时，会使细胞因受到刺激产生某种方式的代偿，细胞代谢增强，线粒体活性增加，产生较多的琥珀酸脱氢酶使外源性的MTT还原生成较多的蓝紫色结晶甲瓒，但随着药物作用时间的延长，“正邪相抗”的平衡被打破，正气渐强时，细胞活性最终受到抑制。流式细胞术结果也发现，益气活血方能促进其凋亡。因此，我们的研究表明，益气活血方可以有效地抑制LX-2细胞增殖，促进LX-2细胞凋亡，为将来更进一步的研究提供实验参考。

致谢：真诚感谢第四军医大学军事预防医学系放射医学教研室郭国祯主任、王晋副教授，感谢他们在实验平台、技术等多方面给予的指导和帮助，感谢第四军医大学细胞工程学研究中心边惠洁教授给予LX-2细胞系。

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