李云振葛安国王庆波高宏志王明席★胡伟鹏★

·综述·

幽门螺杆菌抗生素耐药性基因检测：下一步？

李云振1，2葛安国3★王庆波1高宏志4王明席1★胡伟鹏4★

抗生素耐药性是目前幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）根除治疗失败的重要原因。对于提高临床治疗效果，在某一地区的人群中H.pylori耐药发生率也应考虑。高效、快速、准确地检测出H.pylori抗生素耐药性和及时监控群体耐药发生率对提高临床治疗效果具有重要意义。目前，H.pylori抗生素的耐药机制逐渐清楚，这有助于探索新的检测方法、尤其是核酸检测技术。该文总结了用于H.pylori根除治疗最常用抗生素的主要耐药机制，并着重回顾了H.pylori抗生素耐药的基因检测技术进展，以期对改进H.pylori抗生素耐药的分子诊断提供理论指导和实践借鉴。

幽门螺杆菌；抗生素耐药；基因检测

人类致病菌幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的发现和研究已经使人类对于上消化道疾病有了重新认识，并彻底改变了对该类病人的管理方式［1］。据报道，世界范围内有近一半人口被H.pylori感染［1］。目前，H.pylori已被认为是急性和慢性胃炎的致病菌，同时也是消化性溃疡、胃癌和胃淋巴瘤的主要诱因［2］。治疗该类疾病的常规方法是运用抗生素根除H.pylori［1］。

目前，临床上用于根除H.pylori的常用抗生素种类和数目并不多，但耐药性问题越来越严重，耐药性产生是H.pylori感染治疗失败的重要原因。本文在简单总结H.pylori常用抗生素主要耐药机制的基础上，着重回顾了H.pylori抗生素耐药性基因检测技术进展，以期对本领域的发展提供理论指导和实践借鉴。

1 一线治疗药物耐药基因检测

1.1 克拉霉素

克拉霉素是当前治疗H.pylori效力最强的抗生素，其耐药性涉及23S rRNA基因V功能域内发生的点突变。这些点突变能够抑制克拉霉素与核糖体亚基的结合，从而引起H.pylori产生耐药性［3］。

目前，克拉霉素耐药性基因检测手段主要包括限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）、实时定量PCR（real time polymerase chain reaction，RTPCR）等。PCR-RFLP是最早使用且较为简便的方法，从胃活检标本中直接提取DNA后，使用PCRRFLP可在一天内完成H.pylori感染和耐药性的检测［4］。其能检测的与克拉霉素耐药性相关的点突变包括A2142G、A2143G、A2142C、T2717C［5－7］，其中发现A2142G和A2143G最常见且最重要。然而研究表明其它克拉霉素耐药性相关突变在某些地区也较常见，如T2717C在意大利为常见突变［6］。同时采用巢式PCR-RFLP（nested PCR-RFLP）可提高该方法的敏感性和特异性。该方法也可无需细菌培养而直接检测胃液样本和粪便样本的H.pylori，是一种快速筛查H.pylori克拉霉素耐药性的非入侵性方法［6］，且与酶联免疫吸附剂测定方法（ELISA）相比，具有很高的敏感性和特异性，分别为100％和90％［8］。最近该方法已经被某些国家采用，如伊朗等，开展全国性H.pylori对克拉霉素耐药性发生率的群体检测研究［9］。

荧光原位杂交技术是唯一可以直接对活检标本中微生物进行特异性可视化的检测方法［10］。该方法检测对象一般为A2142G、A2143G、A2144G。与PCR相比，其检测样本常为福尔马林固定组织或石蜡包埋切片，无需提取细菌DNA，对完整样本可进行半定量检测，不到3小时即可完成检测，与传统检测方法如与Etest［11］结果的一致性可达92.4％［12］。目前已经开发出商业性的试剂盒，其检测克拉霉素耐药性的敏感性和特异性分别可达90％和100％［13］。最近，肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）-荧光原位杂交技术（PNA-FISH）使该方法也得到了改进，以H.pylori悬浮液为标本，PNA-FISH可获得100％的敏感性和特异性［14］。随后的研究以石蜡包埋胃活检标本为实验样本，检测结果与PCR测序结果完全一致，敏感性和特异性分别为91％和84.2％［10］。

如果不计成本的话，实时定量PCR是目前用于检测克拉霉素耐药性最为理想的方法。该方法检测点突变的范围较广，提取DNA后的检测时间仅需1小时［15］，且该方法可同时处理多个样本。目前市场上已存在基于实时定量PCR技术检测H.pylori克拉霉素耐药性的试剂盒，且敏感性和特异性分别可达91％和96％［15］，更重要的是，该方法还可以对耐药菌进行准确的定量，最低可准确定量300个细菌［16］。检测样本可包括胃活检样本、粪便标本、福尔马林固定标本和石蜡包埋胃活检标本等，无需细菌培养［17－18］。

此外，近年来也出现了新的检测技术和诊断试剂盒，其中主要包括DPO（dual prim ing oligonucleotide）、M icroarray、GenoTypeHelicoDR［19－21］。DPO是一种新的引物技术。由于DPO通常很长，一般可达35 bp，同时含有两个引发区域，所以该引物具有很高的特异性，可用于检测单核苷酸的多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。最近的研究表明，与实时定量PCR相比，其灵敏度可达97.7％，同时具有更高的特异性（83.1％vs 80.7％），可以作为实时定量PCR的替代检测工具，并且也已存在相应的试剂盒［22］。需要强调的是该技术应

用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药性在韩国已进入临床试验（NCT01453036）［23］。M icroarray是比较热门的高通量检测技术，近几年也用于简单快速检测H.pylori感染并同时检测其致病性相关的基因型及耐药性。该技术主要依赖于特异性探针的设计［20］。基于酶比色法建立的DNA芯片可直接对胃组织进行检测，其结果与DNA测序的结果具有96.83％的一致性，同时灵敏度可达1.53×102copy／m L［24］。GenoType HelicoDR是基于另一成功应用于结核分支杆菌耐药性检测的试剂盒（GenoType MTBDR）而开发的新型基因检测方法［21］。该方法属于DNA条带技术，后者基于多重PCR与反向杂交的结合，成本相对低廉且易于操作，敏感性和特异性很高［21，25］，可分别达94％和99％，阳性和阴性预测值分别为99％和94％［21］。最近，该方法已被南非用来开展整个国家的H.pylori抗生素耐药性检测［26］。

1.2 甲硝哒唑

甲硝哒唑属于硝基咪唑类抗生素，是一种廉价的药物。甲硝哒唑耐药机制涉及rdxA基因的不同突变，这些突变使电子传递链组件烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinam ide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）硝基还原酶失去活性，进而无法激活甲硝哒唑产生硝基阴离子自由基、亚硝基衍生物和羟氨以破坏DNA螺旋结构。这也是引起H.pylori甲硝哒唑耐药的可能主要机制，但是rdxA基因涉及的突变数目和类型较多、缺少规律性［27］，这增加了甲硝哒唑的耐药基因检测的难度。此外，研究表明甲硝哒唑耐药还涉及其他还原酶的失活［28］。

总体上说，只在DNA水平上检测甲硝哒唑耐药性还不能指导用药。尔后发现，从RNA水平上检测相关基因是甲硝哒唑耐药性检测的一种准确方法［29］，而从蛋白质水平检测甲硝哒唑耐药性也已在临床菌株中得到了验证，后者如RdxA蛋白质的缺失可以快速确定大多数临床甲硝哒唑耐药株［30］。

1.3 阿莫西林

阿莫西林属于β-内酰胺类抗生素大类中的青霉素类抗生素，具有很高的杀菌活性，可包含在用于H.pylori根除的所有治疗方案中［1］。稳定的阿莫西林耐药性涉及不同的机制［31－32］。其中，青霉素结合蛋白基因1A（pbp 1A）突变是稳定H.pylori阿莫西林耐药的常见机制，该基因的突变降低或消除了阿莫西林与青霉素结合蛋白的亲和性，后者在细胞壁的合成过程中具有重要作用［33］。此外，关于其他青霉素结合蛋白（PBP2和PBP3）的编码基因突变，也可能都与阿莫西林耐药有关［32］。虽然绝大多数研究表明β-内酰胺酶的产生在H.pylori内并不活跃，但已有研究发现了由内酰胺酶产生引起的H.pylori阿莫西林耐药性，该耐药机制通常会引起高水平耐药（≥256mg／L）［31］，因此，对H.pylori有必要进行该耐药基因的监控，以有效控制该基因的水平传播。

令人遗憾的是，目前鲜有关于阿莫西林耐药性基因检测方法的报道，可能有以下几个原因。首先，尽管研究表明pbp 1基因的突变是稳定H.pylori阿莫西林耐药的常见机制，但是涉及的突变类型和突变数量较多，且该机制引起的耐药水平较低。其次，内酰胺酶产生引起的H.pylori阿莫西林耐药性虽然很高，但该机制的发生较罕见［31］。最后，膜通透性降低或阿莫西林外排泵系统作为高水平阿莫西林耐药性的可能机制，涉及的突变并未明确［34］。

总之，基因检测方法应用于阿莫西林耐药性的检测需要对相关耐药机制，特别是pbp 1基因突变更加深刻的理解。尽管如此，据报道与H.pylori阿莫西林耐药性有关的绝大多数突变位于或临近PBP第二和第三个关键序列。其中PBP1 SKN关键序列附近的Ser414 Arg、位于PBP1 KTG关键序列中心的Thr556Ser以及临近PBP1 KTG关键序列的Asn562Tyr和Thr593Ala是比较重要的常见替换突变［35－36］，或许是基因检测方法的理想靶点。

2 二线治疗或补救治疗药物耐药基因检测

2.1 左氧氟沙星

左氧氟沙星作为新一代氟喹诺酮类，具有广谱抗菌作用，在一线疗法、甚至二线疗法失败后的补救治疗中效果理想，用左氧氟沙星来根除H.pylori的方案正在世界范围内得到推广［37］。gyrA喹诺酮类药物耐药性决定域（QRDR）上的点突变可阻止左氧氟沙星与DNA促旋酶（包括亚单位A和亚单位B，分别由gyrA和gyrB编码）的结合，引起细菌的耐药［38］。此外，最近的研究已确定gyrB上的突变，Glu463Gly，是引起H.pylori氟喹

诺酮类耐药的另一新的机制［39］。

至今，关于氟喹诺酮类药物耐药性的分子检测方法可包括实时定量PCR、等位基因特异性PCR（allele specific polymerase chain reaction，

AS-PCR）和最近的GenoType HelicoDR［21，40－41］。实时定量PCR采用的是荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）熔解曲线分析方法（FRET-RT-PCR）。根据熔解温度的差异，该方法可以快速识别出主要突变（gyrA）包括Asn87Lys、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr［40］。AS-PCR是一种比较简单的方法，可在3～4小时内完成检测，其能够检测的突变形式与实时定量PCR相同［41］。GenoType HelicoDR作为已经上市的试剂盒，在检测左氧氟沙星耐药性方面具有不错的表现，是目前针对左氧氟沙星耐药性较为理想的基因检测方法。该方法检测时间不到6小时，可准确地检测较多的突变，包括Asn87Lys、Asp91Gly、Asp91Asn、Asp91Tyr、Asp86Asn、Thr87Tyr，前4种为主要检测对象。该方法可直接对胃活检标本进行检测，无需培养，且敏感性、特异性、阳性和阴性预测值分别可达83％、95％、91％和91％［21，25］。最近在南非对H.pylori的抗生素耐药性调查中，该方法被证明可以简单、快速地确定左氧氟沙星耐药发生率（10.26％）［26］。

2.2 四环素

图1 幽门螺杆菌常用抗生素主要耐药机制Figure 1 Main resistancemechanisms ofmost-commom ly used antibiotics for H.pylori eradication

四环素是常常作为二线治疗方案、特别是四联疗法中的基本抗生素。虽然该药物的细菌耐药性并不常见，但似乎在不断增加。四环素耐药性主

要由16S rRNA内四环素初级结合位点（Tet-1）的点突变引起，这些突变导致四环素与30S核糖体亚基亲和力降低［42］。

关于四环素耐药性的基因检测方法的报道目前仅涉及PCR-RFLP和实时定量PCR两种方法。其中PCR-RFLP仅对三重突变AGA926-928TTC进行检测。该方法可以将高水平四环素耐药菌株从低水平耐药菌株中区分开，因而可以作为四环素耐药性快速筛查方法［43］。然而，最近的研究表明，对其他突变的检测也是有必要的，尽管这些突变通常引起的耐药性水平较低［44］。通过熔点温度分析，实时定量PCR不仅可以鉴别最重要的三重突变AGA926-928TTC，而且也可以检测二重突变如AGA926-928GGC、AGA926-928GTA、AGA926-928TTA、AGA926-928ATC、AGA926-928TGC，以及单突变如AGA926-928ATA、AGA926-928GGA。同时，此方法不仅可应用于从培养液提取的DNA，而且也可以直接应用于从新鲜或冷冻胃活检样本提取的DNA，大大缩短诊断时间［45］。实验表明，该方法的敏感度可达每微升含10个基因组拷贝H.pylori，且无特异性问题［45］。最近的研究表明，该方法与传统方法相比的一致性可达97％［46］。

表1 幽门螺杆菌耐药性基因检测突变和方法汇总Table 1 Summary of mutations and methods for antibiotic resistance genes detection of H.pylori

3 三线治疗或补救治疗药物耐药基因检测

3.1 利福平和利福布汀

利福平和利福布汀属于利福平类抗生素，与氟喹诺酮类抗生素一样，此类药物一般用于H.pylori感染的补救治疗。利福平／利福布丁耐药性与rpoB基因的突变有关，其编码RNA聚合酶β亚基［47］。

由于利福平类抗生素耐药率还处于非常低的水平，且该药物一般只用于H.pylori感染的补救治疗，目前还没有关于利福平类抗生素耐药性基因检测的报道。不过，重要的突变位置位于525-545氨基酸处（Leu525Pro、Gln527Lys、Gln527Arg、Asp530Val、Asp530Asn、His540Tyr、His540Asn、Ser545Leu）和585氨基酸处（Ile586Asn、Ile586Leu）［47－49］。

4 总结与展望

不可否认，越来越多基因检测方法已应用于H.pylori抗生素耐药性的筛查，其中，针对克拉霉素耐药性的基因检测和诊断已臻于成熟。然而，总体上讲，H.pylori抗生素耐药性基因检测的效果有待于改善，还有许多问题需要解决。比方说，关于甲硝哒唑耐药性和阿莫西林的基因检测仍是个难点，更加深入的耐药机制研究和更加高效的基因检测方法将有助于该问题的解决。至于其他抗生素，如利福平类抗生素，虽然其耐药率还很低，但不能排除应用基因检测方法对其进行快速及时监控的必要性。更重要的是，目前H.pylori抗生素耐药性基因检测仅仅针对较为明确的耐药机制和突变，同时检测的抗生素种类和突变范围也有限，以

及鲜有涉及外排泵系统或膜通透性耐药机制，因而这种检测还需要在这些方面改进。另外，关于具体的突变与临床H.pylori抗生素耐药水平的定量关系也需要进一步的阐明。至于具体的基因检测方法，实时定量PCR是目前比较理想的基因检测方法。然而，该方法还是很难达到同时进行多种抗生素耐药性、多基因靶点分析的需要，昂贵的维护和检测成本也限制了该方法的大规模的应用。值得注意的是，目前测序技术，尤其是高通量测序技术（二代测序技术和三代测序技术），虽然还很少应用于幽门螺杆菌抗生素耐药性基因检测，但是随着测序成本的不断降低和测序时间的不断缩减，相信高通量测序将会在幽门螺杆菌耐药性基因检测方面充分发挥其用武之地。因此，除了更加深入的耐药机制研究以外，更加全面、高效、快速、低廉、高通量、多靶点检测技术是未来H.pylori抗生素耐药性基因检测的发展方向。

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Antibiotic resistance genes detection of Helicobacter pylori:the next step?

LIYunzhen1,2,GE Anguo3★,WANG Qingbo1,GAO Hongzhi4,WANG M ingxi1★,HUWeipeng4★
(1.Yun Leung Laboratory for Molecular Diagnostics,School of Biomedical Science and Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University and Engineering Research Center of Molecular Medicine,Ministry of Education, Xiamen,Fujian,China,361021；2.Wenzhou Institute of Biomaterials and Engineering,Wenzhou,Zhejiang, China,325011；3.Linyi Rongjun Hospital,Linyi,Shandong,China,276005；4.Research Center,The 2nd Affliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou,Fujian,China,362000)

Antibiotic resistance of Helicobacter pylori is themost important reason for failure of its eradication.Overall prevalence of related antibiotic resistance in the region should be also considered for an effective treatment.It is clinically important to detect H.pylori antibiotic resistance efficiently andmonitor its incidence in local population timely.With themechanisms of antibiotic resistance for H.pylori becoming clear gradually,more diagnostic methods,especially themolecular technologies come to the fore.In this review,the main resistancemechanisms of themost commonly used antibiotics in H.pylori eradication therapy were briefly discussed and the progresses in molecular diagnostic technologies were emphaticallysummarized,which may provide theoretical guidance and practical reference formolecular diagnosis of H.pylori antibiotic resistance.

Helicobacter pylori；Antibiotic resistance；Resistance gene detection

福建省科技厅重大项目（2012Y4009）；福建省自然科学基金（2011J01220）；福建省教育厅资助课题（JA09118）；厦门市科技计划（3502Z20123036）；中央高校基本科研业务费专项资金（12J0445*，13J0493*）；华侨大学引进人才科研启功费（12Y0317*）；泉州市科技项目（No.2010Z87）

1.华侨大学生物医学学院＆分子药物研究院＆分子药物教育部工程研究中心，润良分子诊断研究室，福建，厦门361021 2.温州生物材料与工程研究所生物材料事业部，浙江，温州325011 3.山东省临沂市荣军医院，山东，临沂276005 4.福建医科大学附属第二医院神经外科，中心实验室，福建，泉州362000

★通讯作者：葛安国，E-mail：geanguo＠126.com；王明席，E-mail：mxwang＠hqu.edu.cn；胡伟鹏，E-mail：hwplcj＠sina.com

注：李云振，葛安国为并列第一作者