王昌富彭长华李琳芸梅冰

·论著·

糖皮质激素个体化用药系统平台的建立与评价

王昌富1.2★彭长华1.2李琳芸1.2梅冰1.2

目的建立可靠的糖皮质激素（GC）实验诊断系统平台。方法采用超高效液相色谱串联质谱法检测人工合成GC药物（泼尼松、甲基泼尼松和地塞米松）血药浓度，流式细胞分析法检测糖皮质激素受体（GR）-α蛋白，逆转录实时荧光基因扩增定量分析法检测GR-αmRNA，并进行了方法学分析。结果质谱法检测PNS、DPNS、DX血药浓度分别在1～15 ng／m L、1～100 ng／m L、20～400 ng／m L范围内线性关系良好。标本置26℃6 h、置－20℃30 d、加甘油三酯13.21 mmol／L、加总胆红素162.8μmol／L，比较各组血药浓度未发现统计学差异。PNS、DPNS、DX血药浓度日内CV分别小于10.81％、7.98％、5.47％，日间CV分别小于10.72％、6.29％、12.36％。回收率试验显示PNS、DPNS、DX在20 ng／m L、20 ng／m L、400 ng／m L浓度的平均回收率分别是99.91％、102.49％、109.89％。流式细胞术分析GR-α蛋白，标本立即处理检测与放置6 h、24 h后处理检测结果比较无统计学差异，标本处理后5 h检测结果无显著性变化，3种抗体反应条件（室温孵育30 m in、37℃孵育30 m in、4℃孵育6 h）检测结果无统计学差异，百分率及荧光强度CV值分别为3.4％与9.8％。逆转录实时荧光基因扩增定量分析法检测GR-αmRNA检测灵敏度达到101copies／μL，批内和批间Ct值变异系数均小于2.0％。结论初步证实本体系设计科学、方法先进、系统可靠。

糖皮质激素；个体化用药；质谱

糖皮质激素（glucocorticoid，GC）由肾上腺皮质束状带细胞合成与分泌，广泛介导人体生物学效应，包括调节物质代谢、炎症反应、免疫应答等多种生理和病理过程。人工合成GC是常用的治疗药物之一，通过糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）介导发挥药效，具有抗炎、抗毒、抗肿瘤和免疫抑制作用。作为配体发挥作用的主要受体，GRα蛋白几乎表达于所有的被检测的组织与细胞中，并入核与GRE序列结合调节基因表达［1，2］。因此，检测血药浓度、受体分子水平和基因表达状况，建立可靠的糖皮质激素实验诊断系统平台对于协助制定针对患者的个体化治疗方案、疗效监测，从而确保GC个体化用药的临床效果很有意义。

1 材料与方法

1.1 本实验诊断平台所涉及的项目、方法、器材与仪器［3－5］。

1.1.1 GC血药浓度的检测

采用超高效液相色谱串联质谱法，检测仪器为UPLC-ACQUITY®TQD（WATERS，USA），标准品为PNS-d4、DPNS-d4、DX-d5（Torarto Research Chemicacs），提取液使用二氯甲烷，流动相A为0.02％甲酸乙腈，流动相B为0.02％甲酸水，色谱纯。

1.1.2 GR-α蛋白和GR-αmRNA表达水平的检测

采用流式细胞分析法检测GR-α蛋白，仪器为Epics XL Flow Cytometer（Beckman Coulter，USA），标准品采用兔抗IgG（Coulter Immunotech），主要试剂为兔抗人的GR-α多克隆抗体（Santa Cruz）、FITC标记的羊抗兔二抗（Sigma）、细胞破膜剂（Coulter Immunotech）。

1.1.3 GR-αmRNA测定采用逆转录实时荧光基因扩增定量分析法

仪器为7300 Real Time PCR System（Appied Bio Systems，USA）。反应体系：Prem ix ExTM Taq（2×）25μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10 μM）1μL，荧光探针（10μM）2μL，ROX Reference Dye（50×）1μL，已制备的cDNA模板3μL，加水使总反应体积为50μL。反应条件：采用两步法，首先95℃预变性30 s，然后95℃变性5 s，60℃退火和延伸31 s，共40个循环。GAPDH为内标。利用已制备的已知拷贝数的重组质粒（重组载体：大肠杆菌DH52α，上海英俊公司）制作标准曲线，通过双标准曲线法计算GR-αmRNA的相对含量。

2 性能评价方法

2.1 血药浓度检测

2.1.1 标准曲线

将3种标准物质的贮存液（1mg／m L）进行梯度稀释（表1），以标准品与相应内标峰面积的比值f对浓度c作线性回归分析。

表1 标准曲线应用液浓度（ng／m L）Table 1 The standard curve w ith concentration（ng／m L）

2.1.2 标本稳定性与干扰试验

将基质血清添加10管，按表2处理。以A管为基准，其余各管测定值与基准值比较。

表2 标本稳定性与干扰试验Table 2 Sample stability and interference test

2.1.3 精密度与回收率试验

取1.5m L离心管15支，分别加入空白血清270μL。每5管分别加入S2、S3、S4的标准应用液30μL。每天检测5管计算日内精密度，3日共检测15管计算日间精密度，并计算加标回收率。

2.2 GR蛋白表达

2.2.1 标本稳定性

标本获取后立即处理检测或者分别于4℃保存放置6 h、24 h后处理检测；标本处理后立即检测或者处理后于4℃避光保存放置3 h、4 h、5 h、20 h、24 h检测。

2.2.2 检测抗体孵育条件

室温孵育30m in、37℃孵育30m in、4℃孵育6 h。

2.2.3 检测精密度

以标准检测程序对标本重复检测5次后计算阳性细胞百分率及荧光强度的CV值。

2.3 GRmRNA水平

2.3.1 标准曲线

对质粒原液进行稀释，制备出不同浓度梯度的质粒标准品：101～105copies／μL，进行TaqMan实时定量PCR。

2.3.2 精密度

将102copies／μL和104copies／μL的标准品平行操作5次或在5天内分别测定，获取批内与批间变异系数。

3 结果

3.1 血药浓度检测

3.1.1 标准曲线

PNS、DPNS、DX标准曲线回归方程分别为：c＝－0.075＋24.747f（r＝0.9969）、c＝0.089＋96.240f（r＝0.9998）、c＝－6.440＋14.071f（r＝0.9995）。结果表明，PNS、DPNS、DX血药浓度分别在1～15 ng／m L、1～100ng／m L、20～400ng／m L范围内线性关系良好。

3.1.2 标本稳定性与干扰试验

各组间PNS、DPNS、DX血药浓度差异无统计学意义。表明药品在血清中稳定（S2：F／P＝0.792／0.563、0.407／0.841、1.373／0.260；S3：F／P＝0.997／0.434、1.045／0.399、1.429／0.236）。UPLC－MS图谱见图1。

3.1.3 精密度与回收率试验

PNS、DPNS、DX在3种血药浓度的日内（n＝5）CV分别小于10.81％、7.98％、5.47％。日间（n＝15）CV分别小于10.72％、6.29％、12.36％。PNS、DPNS、DX在S2浓度的平均回收率分别是99.91％、102.49％、109.89％。

3.2 GR蛋白表达细胞阳性率和荧光强度

标本立即处理检测与放置6 h、24 h后处理检测结果无统计学差异。标本处理后5 h检测结果无统计学差异。3种反应条件无统计学差异（使用SPSS11.5进行方差分析，均P＞0.05）。CV值分别为3.4％与9.8％。

3.3 GRmRNA水平

3.3.1 标准曲线

直线回归方程y＝－3.388x＋37.198，相关系数r＝0.9885，显示模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系。检测灵敏度达到10 copies／μL。

3.3.2 精密度

数据分析结果显示批内和批间Ct值变异系数均小于2.0％，表明实验重复性良好。

4 讨论

整体水平上，GR基因表达水平的高低和GR分子密度的多少与糖皮质激素的敏感性不同有关。GC用于临床后多数患者可明显改善症状，取得良好治疗效果，而部分患者对GC治疗存在抵抗；GC在临床治疗中越广泛的应用，而个体反应性差异和耐药性等问题则日益明显凸显［6－8］。因此建立检测GC血药浓度、GR蛋白分子和GR基因表达水平的综合实验诊断平台对于选择和确定GC治疗方案非常必要。

图1 糖皮质激素检测UPLC-MS图谱Figure 1 UPLC-MSmaps of glucocorticoid detection

表3 GR-αmRNA的批内和批间精密度检测结果Table 3 The testing results of intra batch and inter batch precision GR-αmRNA

本文对于检测方法的稳定性、特异性、重复性和线性等关键实验因素进行了系统评价，初步证实本体系设计科学、方法先进、系统可靠。从GC的药理本质方面进行研究，不仅可以检测GC血药浓度，还能反映GR基因表达水平和GR分子密度，应用临床医疗后将在个体化用药方案中发挥极大的作用。

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Establishment and evaluation of glucocorticoid individualized medication system platform

WANG Changfu1.2★,PENG Changhua1.2,LI Linyun1.2,MEIBing1.2
(1.Department of L aboratory M edicine,Jingzhou Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou,Hubei,China,434020；2.Department of Immunology Research,School of Medicine,Yangtze University,Jingzhou,Hubei,China,434020)

Objective To establish reliable glucocorticoid hormone experimental diagnosis system platform.Methods Blood drug concentrations of synthetic glucocorticoid(GC),including prednisone (PNS),methyl prednisone(DPNS)and dexamethasone(DX),weremeasured through ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Expression levels of Glucocorticoid receptor-alpha(GR-α)protein were detected through flow cytometry.mRNA levels of GR-αwere measured by using reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR.Methodological index were also analyzed,including sensitivity, precision,interference and recovery ratio,etc.Results Detections of PNS,DPNS and DX blood concentration using mass spectrometry showed good linear relationship in 1－15 ng/m L,1－100 ng/m L and 20～400 ng/m L,respectively.Preservation of specimens in 26℃for 6h,－20℃30 days,addition of 13.21 mmol/L triglyceride or 162.8μmol/L total bilirubin had no significant effect on the results.The intra-day CVs of PNS,DPNS and DX blood concentration were less than 10.81％,7.98％and 5.47％,and inter-day CV less than 10.72％,6.29％and 12.36％,respectively.The average recovery ratio of PNS,DPNS and DX

Glucocorticoid；Individualized medication；Mass spectrum

湖北省科技厅攻关计划引导项目（2007AA301C54）

1.华中科技大学同济医学院附属荆州医院检验医学部，湖北，荆州434020 2.长江大学医学院免疫研究室，湖北，荆州434020

★通讯作者：王昌富，E-mail：jzyyjyk＠sina.com

(concentration at 20 ng/m L,20 ng/m L or 400 ng/m L,respectively)were 99.91％,102.49％and 109.89％.No significant difference existed between the levels of GR-αprotein detected immediately and after preserving samples for 6h or 24 h using flow cytometry.The results detected at 5h time point after sample processing also showed no significant discrepancy.The results of 3 antibody reaction conditions(incubation for 30 m in at room temperature,30 m in at 37℃or 6 h at 4℃)were no statistically different.The precision test showed CVs of percentage and fluorescence intensity were 3.4％and 9.8％.The sensitivity of GR-α mRNA detection w ith reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR was up to 101copies/L.The precision test showed that the intra-and inter-assay coefficients of variation were both less than 2％.Conclusion The glucocorticoid hormone experimental diagnosis system platform is prelim inarily confirmed to be scientific,advanced and reliable.