向阳蓝艳罗宏成陈健明吴成将蒋远文韦叶生★

·论著·

广西壮族及汉族人群CD40基因rs4810485 G／T遗传多态性

向阳1蓝艳2罗宏成1陈健明1吴成将1蒋远文2韦叶生1★

目的研究CD40基因rs4810485 G／T多态性各等位基因及基因型在广西地区壮族及汉族人群中的分布频率，比较其在不同种族间分布的差异。方法采用单碱基延伸的PCR技术和DNA测序法检测195例壮族人和200例汉族人的CD40基因rs4810485 G／T多态性，比较两组CD40基因型及等位基因的分布频率；并结合文献进行不同种族间的比较分析。结果在壮族人中GG基因型占24.1％、GT基因型占49.2％、TT基因型占26.7％；在汉族人中GG基因型占30.0％、GT基因型占47.0％、TT基因型占23.0％。在广西壮族及汉族人群中CD40基因多态性的分布频率差异均无显著性（P＞0.05），但与波兰人、英国人及西班牙人比较，CD40基因多态性的分布频率均存在显著性差异（P＜0.05）。结论在广西地区壮族及汉族人群中存在CD40基因多态性，其基因多态性的分布频率差异无显著性，但与其他种族人群比较存在显著性差异。这种差异对于人类学的研究可能起重要的作用。

CD40；基因多态性；种族

CD40（白细胞分化抗原-40）是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，分布于多种免疫细胞及肿瘤细胞表面。与其配体CD40L结合后，可以将细胞外的信号传导至胞内，引起一系列生物学效应［1，2］。编码它的基因位于20号染色体长臂（q12-q13.2）上，含有9个外显子和8个内含子。CD40基因存在着基因变异及基因多态性，这种基因多态性与人类动脉粥样硬化性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤的关系，已成为国内外学者研究的热点［3－5］。为此，我们应用单碱基延伸PCR技术和DNA序列测定法，进行CD40基因多态性研究，对认识遗传因素的发病作用具有重要意义；同时，确定其在正常人群中的分布，将为人类学及群体遗传学研究提供前瞻性基础资料。

1 对象与方法

1.1 对象

广西地区壮族人195例，其中男115人，女80人，年龄25～72岁；汉族200例，其中男110人，女90人，年龄22～75岁。血常规、血脂及其他生化指标均在参考范围内，心电图检查正常，排除肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管等疾病。全部研究对象均来自右江民族医学院附属医院，为正常健康体检者，且相互间无血缘关系。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采集体检健康者静脉血3 m L，用EDTA-K2抗凝；采用我们已建立的改良碘化钠法［6］提取白细胞基因组DNA，－70℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

根据CD40基因rs4810485 G／T位点多态性和已知的DNA序列设计PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增CD40基因包含rs4810485 G／T位点碱基的DNA片段的引物，上游引物序列为：5′-ATCCCCCAAGTACC TGGCTCCT-3′；下游引物序列为：5′-CCTTGCT GCTTCCCTTGCTTTC-3′，延伸引物为：5′-TTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTACTTTAGA G G GCTGTAGATTCC-3′。

1.2.3 PCR扩增

CD40的PCR扩增反应体系为20μL，其中含10×PCR缓冲液2.0μL，0.3 mmol／L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至20μL。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，PCR产物经虾碱酶（SAP）（Promega）和外切酶I（EXO I）（Epicentre）纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶（SAP）（Promega）纯化后在ABI3130XL上样。SNP分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）来分析。

1.3 统计分析

用SPSS 11.5软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，以P＜0.05为统计学意义。

2 结果

2.1 CD40基因型检测结果

CD40基因rs4810485 G／T多态性，PCR扩增产物片段大小为131 bp。经ABI3130XL基因检测仪SNP分型结果显示rs4810485 G／T位点检测到GG、GT和TT三种基因型。基因测序进一步证实我们的结果（图1）。

2.2 CD40基因多态性在壮、汉两民族人群中分布频率的比较

计算广西壮、汉两民族健康人群中CD40基因型和等位基因频率，经χ2检验，CD40基因rs4810485 G／T位点的基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明所选的研究样本具有群体代表性。其中rs4810485 G／T位点基因型在壮、汉民族中以GT型最为常见，分别占

49.2％和47.0％。其基因型和等位基因频率分布在男女性别间比较无显著性差异（P＞0.05）；广西壮族及汉族人群中CD40基因多态性的分布频率也无显著性差异（P＞0.05）（表1）。

图1 CD40基因rs4810485 G／T测序图Figure 1 Sequencing map of CD40 gene rs4810485 G／T polymorphism

表1 广西壮族和汉族人群CD40基因型和等位基因分布频率的比较Table 1 The distribution of genotype and allele frequencies of CD40 gene in Guangxi Zhuang and Han populations

2.3 CD40基因多态性在不同种族人群间的比较

广西汉族人群CD40基因型和等位基因频率分别与波兰人［4］、英国人［7］、西班牙人［8］比较差异均有显著性（P＜0.05）；而与台湾人［9］及广西壮族人比较差异均无显著性（P＞0.05）（表2）。

表2 不同种族及地区人群CD40基因rs4810485 G／T多态性分布频率的比较Table 2 Comparisons of frequency distribution of CD40 gene rs4810485 G／T polymorphism among different ethnic and regional groups

3 讨论

随着人类基因组研究的进展，人们已经认识到不同的基因背景可以造成某些疾病不同的易感性。对于人类基因多态性的研究已成为必然，其渐成为一种解释不同人群中一些疾病存在不同发病率或不同临床表现、治疗反应及预后的内在机制。广西是我国多民族聚居最突出的地区，通过研究不同民族基因多态性，不仅有助于探索各民族间的相互关系，而且对于探索某些致病基因和易感基因的分布特征、研究某些疾病的发病机理及基因水平的诊断和治疗有重要意义。我们对广西壮族和汉族CD40基因多态性进行对比研究，为探索人类的起源、动脉粥样硬化性疾病、肿瘤及自身免疫性等疾病的基因遗传背景提供理论依据和分子生物学基础。

CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员，是特异性免疫应答的中心分子，广泛表达于免疫细胞表面，包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，同时也表达于上皮细胞、内皮细胞、血小板等非免疫细胞的表面。CD40高亲和力与其配体CD40L结合，对T／B细胞活化和细胞因子的产生起诱导作用，参与多种疾病的发生发展。CD40基因位于20号染色体长臂（q12-q13.2）上，其所编码蛋白产物含有277个氨基酸。CD40基因存在rs4810485 G／T单核苷酸多态性，这种基因多态性的存在可能影响CD40基因的功能，进而可能影响到CD40基因多态性与系统性红斑狼疮、川崎病等的发生发展［10，11］。因此，正确分析和阐明CD40基因多态性在不同种族和地域人群中的分布特点，为进一步研究不同人群中CD40基因多态性与某些疾病的发生发展之间的关系提供理论依据和分子遗传学基础。

我们采用单碱基延伸PCR技术检测了广西地区壮族及汉族正常人群中CD40基因rs4810485 G／T位点多态性的分布情况，结果显示，在壮族人中GG基因型占24.1％、GT基因型占49.2％、TT基因型占26.7％；在汉族人中GG基因型占30.0％、GT基因型占47.0％、TT基因型占23.0％。在广西壮族及汉族人群中CD40基因多态性的分布频率无显著性差异（P＞0.05）；其基因型和等位基因频率分布在男女性别间比较也无显著性差异（P＞0.05）。进一步将中国广西地区汉族人与波兰人［4］、英国人［7］、西班牙人［8］、台湾人［9］等人群基因多态性研究结果比较分析发现，我国广西汉族人群中CD40基因rs4810485 G／T位点T等位基因频率（46.5％）显著高于波兰人（24.3％）、英国人（25.2％）和西班牙人（27.2％），差异具有统计学意义（P＜0.05）；与台湾人及广西壮族人等比较差异无显著性（P＞0.05）。从本文结果可以发现，CD40基因型分布及等位基因频率在不同种族间存在着明显的差异，这一结果符合遗传学规律，即亲缘关系越近，其基因型分布越相似，反之则差异越显著。

综上所述，了解我国壮族与汉族人群中CD40基因多态性的分布，不仅为今后进一步研究我国壮族与汉族人群中CD40基因多态性与一些相关疾病发生、发展之间的关系提供理论依据，也将有助于我们更深入的理解这些疾病在不同种族、不同地区间具有的不同的遗传基因背景；同时也为进一步的人类学及群体遗传学的研究和基因多态性普查奠定了基础，并为进行疾病前瞻性研究提供了重要的基础资料。

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The genetic polymorphism of CD40 gene in GuangxiZhuang and Han populations

XIANG Yang1,LAN Yan2,LUO Hongcheng1,CHEN Jianm ing1,WU Chengjiang1,JIANG Yuanwei2,WEI Yesheng1★
(1.Department of Laboratory Medicine,A ffiliated Hospital of Youjiang Medical University for N ationalities, Baise,Guangxi,China,533000；2.Departmentof Dermatology,A ffiliated Hospital of Youjiang Medical University for N ationalities,Baise,Guangxi,China,533000)

Objective To study the frequencies of allele and genotype distribution of CD40 gene rs4810485 G/T polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations,and to analyze the distributions of CD40 polymorphism among differentethnic groups.Methods The CD40 gene rs4810485 G/T polymorphism was exam ined by the polymerase chain reaction-single base extension(PCR-SBE)technique and DNA sequencing methods in 195 Zhuang and 200 Han populations.Genotype and allele frequencies of CD40 were compared between Zhuang and Han populations，as well as w ith other different races.Results The frequencies of GG,GT and TT genotypeswere 24.1％,49.2％and 26.7％in the Zhuangs,and 30.0％,47.0％and 23.0％ in the Hans，respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of CD40 gene were not significant difference between the Zhuangs and the Hans(P＞0.05).Compared w ith Spanish and Russian populations,the

CD40；Polymorphism；Ethnic

国家自然科学基金（81260234）；广西自然科学基金（2011GXNSFA018198）；广西卫生厅重点科研课题（重2012086）

1.右江民族医学院附属医院检验科，广西，百色533000 2.右江民族医学院附属医院皮肤科，广西，百色533000

★通讯作者：韦叶生，E-mail：wysh22＠163.com

CD40 polymorphism was significantly difference(P＜0.05).Conclusion There are CD40 gene polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations.T he frequencies of polymorphism distribution of CD40 gene were not significant difference between the Zhuang and Han populations.Whose distributions are significantly difference compared w ith others ethnic populations.Itmight play an important role for anthropological research.