马雯 吕微风 郑磊

·综述·

电化学生物传感器在microRNA检测中的应用

马雯 吕微风 郑磊★

M icroRNA（m iRNA）是一种内源性的单链非编码RNA，参与细胞的增殖凋亡分化和代谢等重要生理过程。近年来发现循环miRNA能够耐受RNA酶消化、强酸强碱、煮沸等极端条件，是一种潜在的疾病标志物。因此，miRNA的检测对疾病的早期诊断具有重要的生物学意义。电化学生物传感器由于其简易、便携、灵敏、反应快速以及价格低廉等特点而被研究者广泛应用于m iRNA检测的研究。本文综述了m iRNA的电化学传感器的研究进展，评述了各类方法的优缺点，并对m iRNA电化学检测的发展趋势进行了展望。

m icroRNA（m iRNA）；生物标志物；电化学生物传感器

电化学生物传感器是一门有关化学、物理学、生物学以及电子学等领域的交叉学科，它具有灵敏度高、检测速度快、操作简便、成本低、可进行连续动态监测等优点。其工作原理是：当待测物质经扩散作用进入敏感元件后，与敏感元件生物体成分（酶、激素、抗原、抗体、组织、细胞、细胞器等）特异性结合，发生生物化学反应，所产生的信息通过相应的信号转换元件（固体电极、气敏电极、离子选择性电极等）以转换为定量处理的电信号，再经电子测量仪的放大、处理和输出，即可达到分析检测的目的。

1 miRNA

1993年，人类首次在秀丽新杆状线虫中发现

lin-4，随后又有研究者陆续发现m iRNA广泛地存在哺乳动物、果蝇和植物等生物中［1］。目前已有研究证明，miRNA参与生命过程中的一系列重要活动，包括生长发育、免疫防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发展、心脏发生等［2］。虽然目前对已发现的m iRNA分子功能和作用靶基因的研究还处于初步阶段，但是从miRNA在不同组织和疾病中的表达谱中分析发现，某些miRNA在特定疾病表达谱中具有明显的组织特异性［3－5］。以上研究均表明，m iRNA在疾病发生发展过程中存在非常重要的作用。

2008年，Law rie［6］等在人类血清中首次检测到miRNA，并发现弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清m iR-21表达上调。从此，不少学者将研究方向转到血清和血浆中来。最近几年，相继在乳腺癌、白血病、心肌梗死、肝炎［7－10］等疾病患者中发现循环m iRNA表达量与正常人相比具有明显差异，且在某些疾病中还可用于诊断、分期和预后检测。另还有报道证明循环m iRNA可耐受一些苛刻的环境，如多次反复冻融，强酸强碱、长期保存甚至煮沸［11］。这些研究均证实了m iRNA在血中十分稳定。目前关于血清和血浆样品中m iRNA稳定性的机制虽然还没有定论，但是已发现循环miRNA可与一些蛋白质结合形成复合物，如Argonaute2（Ago2）、核仁磷酸蛋白（nucleophosm in，NPM）、低密度脂蛋白（low densith lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），也可以包含于微囊泡（microvesicle）、外泌体（exosome）、凋亡小体（apoptosis body）等，这些特性均可为其稳定性提供基础［12－13］。

循环miRNA的发现是临床分子生物学革命性的突破，其高度的特异性和稳定性决定了其作为一种新的疾病生物标志物的巨大潜力。因此，找到一种适合的检测方法显得尤为重要。

1.1 miRNA检测的难点

（1）m iRNA成熟体只有20多个bp，降解温度低，故miRNA提取后保存要求较高。（2）同一家族miRNA碱基组成区别不大，有的甚至只有1个碱基的区别。（3）m iRNA合成过程中，由于存在pri-m iRNA、pre-m iRNA、m iRNA成熟体，在检测miRNA成熟体时必须排除其他2种形式的miRNA干扰。（4）miRNA在人体内含量一般较低，对检测方法的灵敏度要求相对较高［14］。

1.2 目前常用的检测方法

目前常用的m iRNA检测技术包括Northern印迹杂交（northern blotting）、微阵列芯片（m icroarray）、实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）等。Northern blotting一般先用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出特定m iRNA，然后利用杂交原理与印迹膜上修饰的标记寡核苷酸探针杂交，通过检测标记进而分析靶m iRNA的含量。但是此方法由于其样品需求量大、灵敏度低、不适合高通量分析等特点而并不适用于临床［15］。微阵列芯片又称基因芯片，其可对m iRNA实行高通量、多组分检测。可这种方法相对费用较高，且存在背景及其他信号干扰导致重复性差，一般只用于初筛，所得结果最终还需实时荧光定量PCR验证［16］。目前临床和科研中最常使用实时荧光定量PCR来进行m iRNA的检测，此方法将逆转录后的cDNA产物进行特异性的扩增，从而大大提高检测能力。但是这种技术对实验条件以及实验操作者要求较高，且检测费用相对较贵。此外，还有研究者利用表面增强拉曼、生物发光、原位杂交、纳米孔技术来检测m iRNA，但是这些方法一般需要特殊仪器，不利于临床大规模开展。若发展一种适用于临床实验室的m iRNA检测方法，应满足以下几点要求：（1）应具备敏感的检测能力，能定量敏感检测出不同临床标本甚至极低丰度的m iRNA；（2）应具备良好的特异性，能区分出高度同源的m iRNA；（3）检测过程相对简便，无需昂贵的设备和试剂。电化学生物传感器由于其简易、便携、灵敏、反应快速以及价格低廉等特点而被研究者广泛应用于m iRNA检测的研究。现就m iRNA电化学检测新技术作一综述。

2 miRNA电化学检测技术

一个典型的m iRNA生物传感器设计原理是将识别元件固定在载体表面，加入可指示杂交信号的电活性物质，通过检测电极在待测溶液中电化学信号的变化，以确定靶m iRNA的浓度。特异性和敏感性是评价m iRNA生物传感器的2个至关重要的因素。特异性主要由识别元件（一般为捕获探针）来决定，敏感性则主要由信号放大技术决定。

2.1 捕获探针设计

所有的miRNA电化学传感器检测方法均存在1个杂交的过程，因此捕获探针的设计显得尤为重要。由于m iRNA的序列较短，所以捕获探针在设计上难度较大。目前常用的是线性寡聚DNA探针、具有茎环结构的分子信标探针、DNA纳米结构的探针。

2.1.1 普通线型探针

一维线型探针合成简单，线性单链DNA探针分子作为识别元件非特异结合较多，配对碱基间结合力弱，无法鉴别单个碱基错配，检测特异性及灵敏度不高［17］。但是又有文献［18］报道可以通过提高杂交温度来消除碱基错配的影响。在37℃时，线性探针无法消除错配的影响，但当杂交温度达到65℃时，单碱基错配的电流信号接近背景值［19］。

2.1.2 分子信标探针

分子信标探针是一种可在核酸5′和3′端自身形成的具有茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状部分与目标序列互补，一般为15～30个碱基。其茎干区的碱基数一般为环状区的一半，过长，灵敏度下降；过短，则稳定性下降。由于分子信标杂交前后环状区与靶分子的双链结构之间存在着热力学平衡关系，它的杂交特异性明显高于常见的线状探针，是目前应用最广的捕获探针。

2.1.3 DNA纳米结构探针

传统的DNA探针通常为一维（单链探针）或二维（茎环状探针）结构，传感界面在制备过程中均一性极难得到有效的控制，从而影响了实际样品检测的重复性和稳定性。三维DNA探针因其高结构稳定性和刚性的特点，可以有效提高DNA探针表面分布排列的均一性，精确调控探针之间的距离，因而显著提高了生物检测的灵敏度和特异性，这一研究结果显示了DNA纳米技术作为新型生物传感平台的巨大潜力［20］。将DNA三维纳米结构探针组装到电化学装置的工作电极表面，使目标m iRNA与工作电极表面DNA三维纳米结构探针杂交，随后加入氧化还原酶和相应的底物使用电化学装置进行电化学检测（图1）。该方法检测限低至10 aM，从而解决了现有技术需要大量检测样品的难点［21］。另外，该检测方法的特异选择性强，能够很好区分同族的m iRNA的碱基错配，与传统探针相比，本方法稳定性更高。

图1 捕获探针为四面体结构的的酶促生物传感器检测示意图［21］Figure 1 Scheme of strategy for am iRNA enzyme biosensor based on tetrahedral probes［21］

2.1.4 其他

识别元件的取代基类型决定了其与靶物质的结合亲和力及稳定性。目前应用于传感器识别元件的核酸寡聚体除了传统的DNA、RNA之外，还有RNA的核酸模拟物（locked nucleic acid，LNA）及DNA的核酸模拟物肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）。锁核酸（LNA）［22］是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-O、4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。与其他寡核苷酸相比，LNA有如下优势［23］：（1）和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；（2）抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；（3）LNA-DNA杂交物能激活RNaseH；（4）水溶性好，自由穿入细胞膜，易被机体吸收；（5）体内无毒性作用。基于以上这些优点，大量基于LNA探针的m iRNA检测方法被大量开发。肽核酸（PNA）是一种人工合成的具有类多肽骨架的DNA类似物，其有如下特点：（1）骨架呈电中性，与靶序列杂交时不受静电排斥作用的影响；（2）杂交活性几乎不受介质盐浓度的影响；（3）PNA／RNA杂交比DNA／RNA杂交更易受碱基错配影响；（4）体内无毒性作用［24］。目前已有研究将PNA作为检测探针与氧化石墨烯结合成功实现在胞内同时检测多种m iRNA，并论证了PNA用于m iRNA检测的优越性［25］（图2）。

图2 基于PNA-NGO复合物的m iRNA生物传感器检测示意图［25］Figure 2 Scheme of strategy for am iRNA sensor based on NGO and PNA［25］

2.2 信号放大技术

由于m iRNA在体内含量极少且本身序列较短，产生的信号很难与背景信号进行区分，所以需要使用信号放大技术将信号进行放大，使检测信号与背景信号很好的区分开来。目前，电化学传感器常用的信号放大技术有纳米材料放大技术、酶催化信号放大、电活性物质放大技术、鸟嘌呤氧化放大技术等。

纳米材料以其独特的化学、光学、磁学、热学、电学等性质引起了科学家的广泛关注。随着纳米材料研究的不断深入，越来越多具有良好电化学性能的纳米材料应用于传感器电极的构建。图3［26］显示了基于纳米结构的微电极阵列电导率的变化来检测单层的电荷中性的吗啉代寡核苷酸与靶m iRNA的杂交过程，将一个亲生物界面的单层的电荷中性的吗啉代寡核苷酸固定在硅烷活化的铟锡氧化物电极上，与靶m iRNA杂交使生物传感器表面形成高密度的负电荷。二甲氧基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢的引入使得在生物传感器表面产生多聚二甲氧基联苯胺复合物膜，该复合物膜的电导率与m iRNA量呈正比。该方法已在溶液中成功检测let-7c，检测限为2fM，且能成功鉴别单碱基错配。但使用临床血标本直接检测时，变异较大，可能是血清中的高蛋白及其他血液成分严重影响m iRNA的测量。研究者又利用硅纳米线场效应管构成CMOS反相器在肺癌细胞和人类血清中成功检测m iRNA（图4）［27］。这种新型的生物传感器首先利用半导体技术在加工的硅纳米线上固定单链DNA探针，当靶m iRNA附着在硅纳米线表面，与DNA探针杂交后，负电荷增加引起电流变化。该传感器检测限达到1zM，并成功检测肺癌细胞以及人类血清中的m iRNA。然而，该传感器的性能易受到工艺偏差的影响。另外，纳米器件本身需要在较低的电压下工作，这将导致器件噪声容限的降低。所以，该传感器将来要运用于临床，还需进一步优化。

图3 基于纳米结构的微电极阵列电导率的变化来检测靶m iRNA的生物传感器示意图［26］Figure 3 Scheme of strategy for a miRNA biosensor based on change of the conductivity of nanom icroelectrode array［26］

图4 硅纳米线场效应管构成CMOS反相器检测m iRNA示意图［27］Figure 4 Scheme of strategy for am iRNAbiosensor based onCMOS-compatible silicon nanow ire field-effecttransistors［27］

目前也有许多方法是利用纳米材料标记来进行信号放大［28］（图5）。该方法先将分子信标捕获探针固定在金电极上，当靶物质与捕获探针互补杂交时，分子信标茎环结构被打开，纳米银标记的寡核苷酸探针随之与捕获探针结合。纳米银在碱性条件下可催化H2O2还原，产生电化学信号。H2O2产生的电化学响应值与m iRNA数量呈正相关。该电化学传感器的检测限达到67fM。但该方法需要对探针预先进行标记，操作较为复杂且相对成本较高。

图5 纳米银标记寡核苷酸探针放大检测miRNA示意图［28］Figure 5 Scheme of strategy for a miRNA biosensor based on oligonucleotide encapsulated silver nanoclusters as probes［28］

酶由于其对相应的底物具有催化转化能力和特异选择作用而被广泛应用于各类化学分析上。电化学酶基因传感器的原理为利用酶对底物的催化，使底物氧化或还原，产生可在电极上进行反应的物质，获得电流信号。例如，将生物素标记的捕获探针绑定在亲和素包被的纳米磁珠上，当探针遇到生物素化的靶m iRNA时发生杂交，此时链霉亲和素标记的碱性磷酸酶就可连接到磁珠上，通过对酶促反应产物进行电化学检测，从而对miRNA进行定量［29］。该方法成功用于检测细胞中m iRNA的表达情况，其灵敏度达到7 pM。随后，又有研究者将捕获探针固定在纳米金修饰的大电极上，在靶物质存在下，石墨烯－血红素复合物（具有类过氧化物酶催化活性）可连接到体系中，从而对miRNA进行定量［30］（图6）。该传感器由于石墨烯组分的引入增强了血红素本身的催化活性，具有协同作用，使其检测限达到0.17 pM，并且成功用于拟南芥幼苗中m iRNA的检测。为了得到更高的灵敏度，有学者又利用四面体纳米探针作为捕获探针，在靶miRNA存在的条件下与生物素标记的2条辅助探针一起形成杂交连锁反应，随后加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，催化H2O2，产生电信号［31］。该方法检测限达到10 aM。但是稍显不足的是，该体系并未用于检测任何临床标本。这种利用2条辅助探针形成杂交连锁结构的体系还需在临床样本中进一步验证。

图6 模拟酶催化系统电化学生物传感器检测m iRNA示意图［30］Figure 6 Scheme of strategy for amiRNA biosensor based on mimic enzyme catalysis system［30］

近年来，不少研究者开发了一系列基于电活性物质直接标记检测m iRNA的方法。例如，将具有氧化还原活性和电催化活性的物质Ru（PD）2Cl2通过与m iRNA上嘌呤碱基的配位作用连接到m iRNA上，催化肼的氧化，检测限可以到200 fM［32］。虽然检测限相比其他方法不是很有优势，但是该方法样品用量很少，并且仅需10 ng的总RNA就能定量m iRNA。但是该方法需要对靶m iRNA进行预先标记，操作较为复杂耗时，不适合临床广泛使用。为了提高灵敏度，有研究者利用［Ru（NH3）6］3＋能够结合带阴性电荷的DNA双链作为指示剂的特点，提出了一种定量检测m iRNA的方法［33］（图7）。在靶物质存在的情况下，可发生杂交连锁反应，形成长的双链片段。［Ru（NH3）6］3＋直接结合双链片段，进而被连接到电极上，产生放大电流信号。该方法检测限达到100 aM，并成功用于血液标本的检测。

由于m iRNA在体内含量极低，需要极为灵敏的方法进行检测，所以研究人员一般更倾向于多种放大技术联用达到多重放大的效果。在固定电极上利用纳米与酶双重放大技术成功检测了细胞中的m iR-21的含量（图8）［34］，该传感器检测限达到0.06pM。另外，还有研究者利用3-氨基苯酚硼酸（3-am ino phenol boric acid，APBA）与具有顺式二醇结构的核糖核酸特异性结合形成酯键的功能成功的将m iRNA与单链DNA区分开来［35］。该传感器使用了修饰了APBA和生物素的纳米金，

与生物素特异结合的亲和素标记的碱性磷酸酶，可使催化产物进行氧化还原循环的三（2-氯乙基）磷酸酯（Tris（2-chloroethyl）phosphate，TCEP），从而实现三重放大。经三重放大后，该传感器检测限达到3 fM。但是该传感器目前只在溶液中检测了miR-21，并未在临床样本中进行验证。虽然多重放大有利于提高传感器灵敏度，但操作较为复杂耗时，且批间差异较大，不适合临床广泛使用。

图7 电活性物质直接标记检测miRNA示意图［33］Figure 7 Scheme of strategy for a m iRNA biosensor based on the electroactivematerials［33］

图8 双重信号放大系统联合联测miRNA示意图［34］Figure 8 Scheme of strategy for amiRNA biosensor based on dual signal amplifier system［34］

2.3 电化学传感器新思路

目前，电化学传感技术所构造的体系一般是用捕获探针将靶miRNA捕获后，在后期通过利用纳米材料、酶、电活性物质等进行一系列的信号放大，从而提高其灵敏度，实现m iRNA的检测。在此过程中一般不涉及m iRNA的数量扩增。目前又有一些新的检测miRNA方案被逐渐提出。在2012年，Yin［36］等利用双链特异性核酸酶进行一步反应成功检测了m iRNA（图9）。当靶m iRNA与DNA探针结合后，此种核酸酶能特异性水解DNA-m iRNA杂交链中的DNA链，而m iRNA保持完整，进而可以与另一条DNA探针结合，此过程不断进行进行，从而增强荧光强度，其检测限达到100 fM。而Jia等［37］则通过设计一段两端相同，中间含有切刻酶酶切位点的探针作为扩增模板，利用m iRNA3′端可以作为DNA引物的特点，在聚合酶的作用下形成双链产物。生成的双链产物在切刻酶酶切位点处切刻，产生新的羟基端继续引发聚合反应。被切刻下来的序列与探针3′端完全互补，又可以引发新的聚合反应，实现对m iRNA的超敏检测，其检测限甚至达到1zM。基于此，未来m iRNA电化学生物传感器或许可以引入等温扩增的概念，与其他技术结合，从数量扩增以及信号放大两方面增加传感器的灵敏度，实现床旁检测（pointof care testing，POCT）。

图9 基于DNSNA酶等温扩增直接检测miRNA示意图［36］Figure 9 Scheme of strategy for a m iRNA biosensor based on Duplex-Specific nuclease signal amplification（DSNSA）［36］

3 展望

血液循环中存在与疾病相关的m iRNA，并且可以耐受RNA酶的破坏而稳定地存在。目前对循环miRNA的研究还处于初步阶段，许多重要的问题急待解决，如研究的病种范围还非常有限、检测的样本数较小（通常仅有几十例）、检测方法繁琐且价格昂贵等，这些问题都将限制其进入临床应用。相信随着对m iRNA研究的深入及检测方法的标准化，循环m iRNA的检测最终将能应用于临床，为疾病无创诊断、治疗和预后提供新依据。如何进一步提高方法的灵敏度、减少操作的烦琐程度、缩短实验反应时间以及降低实验的成本，是各种检测方法的最终追求目标。电化学生物传感器

因其制作简单、灵敏度高、重现性好、成本低、易于实现微型化等诸多优点得到研究者的广泛青睐。未来电化学miRNA生物传感器的研究热点将集中在：（1）传感器设计的的优化：寻求更好的纳米材料进行电极的修饰，更稳定的探针固定方法及更优良的杂交指示剂；（2）增加灵敏度：从数量扩增以及信号放大两方面增加灵敏度；（3）多靶标同时检测：一个仪器同时测量多种靶m iRNA，同时避免相互干扰；（4）微型化：实现POCT，使此类产品渗透到人类的生活中去。

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App lications of electrochem ical biosensors in the detection ofm icroRNA

MA Wen,LV Weifeng,ZHENG Lei★
(Department of Laboratory Medicine,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong, China,510515)

M icroRNAs(miRNAs)are a class of short endogenous non-coding RNAs that involve in diverse biological processes of cells,including development,differentiation,proliferation,and apoptosis.In recent years,accumulating studies have shown that the circulating m iRNAs are resistant to RNase digestion, extreme pH and temperature,and have been proposed as novel biomarkers in diagnostics.The detection of miRNA is of great biological significance for clinical diagnosis.Ow ing to the fact that electrochem ical detector is simple,portable,sensitive,fast response and low cost,electrochemical biosensors have been recognized to be the most promising way for miRNA detection.In this paper,the progress of miRNA electrochemical biosensor is summarized.And the advantages and the disadvantages of all kinds of methods and prospect them iRNA electrochem ical detection trends are reviewed.

M icroRNA(miRNA)；Biomarker；Electrochemical biosensors

国家自然科学基金（81371901）；高等学校博士学科点专项科研基金（20134433110010）；广东省科技计划国际合作项目（2012B050600021）

南方医科大学南方医院检验科，广东，广州510515

★通讯作者：郑磊，E-mail：nfyyzl＠163.com