徐 雷 刘朝选

姜黄素对前列腺癌PC-3细胞热休克蛋白27表达的影响※

徐 雷 刘朝选

目的 探讨姜黄素对前列腺癌PC-3细胞热休克蛋白27（HSP27）表达的影响。方法 体外培养人前列腺癌PC-3细胞，随机将其分为4组，空白对照组不给药；大剂量组给予50 μmol/L姜黄素2 μl；小剂量组给予25 μmol/L姜黄素2 μl；阴性对照组给予等体积二甲基亚砜（DMSO）。采用免疫荧光染色检测PC-3细胞HSP27的表达情况，采用RT-PCR检测PC-3细胞HSP27 mRNA的表达情况。结果 免疫荧光染色结果显示，姜黄素治疗组PC-3细胞HSP27染色强度明显低于空白对照组和阴性对照组，并且大剂量组 HSP27染色强度降低更加明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR分析结果显示，姜黄素治疗组PC-3细胞HSP27 mRNA的表达明显降低（50%和60%），且呈剂量依赖性，与空白对照组比较（128%），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 姜黄素可抑制PC-3细胞HSP27的表达，可能是其抗前列腺癌的机制之一。

姜黄素；前列腺癌；PC-3细胞；热休克蛋白27

HSP27是热休克蛋白（heat shock proteins,HSP）亚家族成员之一，在多种肿瘤细胞中均有过表达，其主要的生物学功能是防止各种应激因素对细胞的损伤。同时，HSP27与调节细胞的增殖、分化及细胞凋亡的信号转导等有关[1]。目前HSP27与肿瘤的关系日益受到重视，但有关 HSP27在前列腺癌发生、发展及预后中所起的作用鲜见报道。姜黄素（curcumin）是从中药姜黄中提取的活性成分，有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化抑制血管生成及特有的抗肿瘤活性[2]。本研究旨在观察姜黄素对前列腺癌PC-3细胞HSP27表达的影响，探讨姜黄素抗前列腺癌的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 姜黄素和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；人前列腺癌细胞PC-3细胞购自中国科学院上海细胞库；F12培养液和胎牛血清购自武汉凌飞科技有限公司；TRIzol试剂盒购自上海华舜公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自Bestbio公司；兔抗小鼠HMGBl抗体和驴抗兔lgG购自英国Abcam公司；青霉素、链霉素和溴化乙啶等购自碧云天生物技术研究所；细胞培养板购自Corning公司；其余试剂均为国产分析纯（北京化工厂）。姜黄素使用二甲基亚砜（DMSO）配制成50 mmol/L储备液，-20C冰箱保存备用，临用前用F12培养液分别配制成25 μmol/L和50 μmol/L溶液。

1.2 细胞培养 PC-3细胞保存在含有 10%胎牛血清的F12营养培养基（含青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml）。按照细胞密度1×106个细胞/孔接种于6孔板中，37 ℃、5% 二氧化碳（CO2）及饱和湿度下培养24 h。每个实验步骤至少重复4次。

1.3 分组及治疗方法 待80%细胞融合后，更换新鲜培养液，并加入不同浓度姜黄素，体外培养人前列腺癌PC-3细胞，随机将其分为4组，空白对照组不给药；大剂量组给予50 μmol/L姜黄素2 μl；小剂量组给予25 μmol/L姜黄素2 μl；阴性对照组给予等体积DMSO。收集培养液用于后续分析，进行免疫荧光染色和RT-PCR检测。

1.4 免疫荧光染色 常规方法收获细胞、胰蛋白酶消化贴壁细胞，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗后，TCM-N3冲洗，50 ml锥形管2000 rpm离心10 min（离心半径r=8.5 cm）。将上清液吸出并重新悬浮于1 ml TCM-N3，滴于载玻片（多聚赖氨酸包被）上吹干，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤5 min，共5次。滴加5 g/L牛血清清蛋白（BSA）封闭液，37 ℃封闭 30 min，加入相应的一抗，兔抗小鼠HMGBl抗体（1∶200），PBS洗涤5 min，共5次。加入荧光标记的二抗，PE标记的驴抗兔 lgG（1∶500），避光，37℃孵育2 h，PBS洗涤5 min，共5次。Hoechst 33342染料避光37 ℃孵育15 min，PBS洗涤，共3次。缓冲甘油封片，荧光显微镜观察、拍照并保存。

1.5 RT-PCR检测HSP27mRNA的表达 按照说明书，TRIzol试剂盒抽提总 RNA，溶于 20 μl DEPC-H2O，依次加入2.5 μL DNA酶，2.5 μl 10×缓冲液，37 ℃水浴30 min后，65 ℃水浴10 min，分光光度法检测RNA浓度。HSP27PCR引物是：5'-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3'（正向）和 5'-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3'（反向），GAPDH扩增产物：5'-GGTCAACGGGTAGG TGTTTG-3'（正向）和5'-GCCTTTGGGCTCTGCAT GAA-3'（反向）。HSP27 PCR反应总体积25 μl。使用GeneAmp 2400热循环仪，预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳（110 V，35 mA，30 min），溴化乙锭染色，BandScan 5.0软件进行电泳结果吸光度积分值分析，HSP27 mRNA表达相对含量值（灰度比）= HSP27吸光度积分值/GAPDH吸光度积分值。

1.6 统计学分析 本次研究数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PC-3细胞免疫荧光染色结果 免疫荧光染色结果显示，空白对照组和阴性对照组HSP27阳性细胞染色强度明显高于大剂量组和小剂量组，且大剂量组HSP27阳性细胞染色强度降低更加明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 PC-3细胞免疫荧光染色结果

2.2 姜黄素对PC-3细胞HSP27 mRNA表达的影响RT-PCR检测结果显示，空白对照组和阴性对照组PC-3细胞的HSP27 mRNA表达水平明显升高，分别为128%和110%；给予姜黄素干预后，PC-3细胞的HSP27 mRNA表达水平明显降低，分别为50%和60%，且大剂量组降低更加明显，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 姜黄素对PC-3细胞HSP27 mRNA表达的影响

3 讨论

HSP是应激条件下产生的高度保守的分子伴侣[3]，是组织和器官受到刺激或应激时表达的主要蛋白质，可参与细胞损伤、防御、修复产生而控制细胞功能[4]。HSP的表达可抑制细胞损伤，对细胞的保护也起到重要作用，如控制细胞凋亡和肿瘤免疫反应[5]。正常组织细胞内 HSP27的表达水平很低。应激状态可致胞内HSP27磷酸化并致其寡聚体解聚，HSP27表达上调。Miyake等[6]报道，HSP27、HSP70、HSP90在前列腺癌细胞表达，根据Gleason评分和病理分期，只有HSP27表达有统计学意义，且HSP27可作为前列腺癌预后判断的重要指标。本研究结果显示，空白对照组和阴性对照组HSP27阳性细胞染色强度明显增高。研究结果[6]与其相一致。

姜黄素是一种从姜黄根茎中提取得到的脂溶性酚类黄色色素，具有重要和广泛的药理作用，如抗突变、抗炎和抗肿瘤等多种作用等[7-8]。姜黄素对多种肿瘤的发生、发展均有明显抑制效果，有多靶向的抗肿瘤作用。目前，姜黄素的抑瘤作用机制主要与其诱导肿瘤细胞凋亡有关，其通过调控抑癌基因，癌基因及其蛋白的表达诱导细胞周期停滞及调控细胞凋亡信号等途径实现的[9]。RT-PCR技术检测姜黄素对前列腺癌PC-3细胞HSP 27 mRNA表达的结果显示，姜黄素可抑制HSP 27 mRNA的表达，且随着剂量的增加，抑制作用增强，具有剂量依赖性。综上所述，PC-3细胞HSP 27 mRNA表达水平明显增高，而姜黄素可以抑制 PC-3细胞 HSP 27 mRNA表达，高浓度的姜黄素抑制作用更强，为寻找治疗治疗靶位提供了基础。有关姜黄素对前列腺癌细胞的凋亡是否有影响，有待于进一步研究。

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[2]阮兴举,刘玉娥,郑政隆.姜黄素对前列腺癌 PC-3细胞的增殖和凋亡的研究[J].成都中医药大学学报,2013,36(1)∶65-66.

[3]李弘夏,谢智钦,杜立.基于 HSP27 的乳腺癌干细胞靶向治疗研究进展[J].中国老年学杂志,2014,34(2)∶561-563.

[4]Okazaki M,shimizu Y,chiba M,et al..Expression of heat shock proteins induced by cyclical tretching stress in human periodontal ligament fibroblasts[J]Tohoku univ Dent J,2000(19)∶108-115.

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Effect of Curcumin on Heat Shock Protein27 Expression in Prostate Cancer PC-3 cell

Xu Lei Liu Chaoxuan

Objective To explore the effect of curcumin on heat shock protein27(HSP27) expression in prostate cancer PC-3 cell.Methods human prostate cancer PC-3 cell cultured in vitro were randomly divided into four groups:control group:without curcumin;high-dose group:50 μmol/L curcumin 2 μl;low-dose group:25 μmol/L curcumin 2 μl;separate negative control group:given equal volume dimethyl.Using immunofluorescence staining detected HSP27 expression in PC-3cell,Using RT-PCR detected HSP27mRNA expression in PC-3 cell. Results Immunofluorescence staining showed that the staining forHSP27 in PC-3 cells was significantly lower in the curcumin treatment group than the control group and the negative group,and the staining forHSP27 in PC-3 cells in the high-dose group decreased more significantly,compared with the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05).And the HSP27 mRNA expression detected by RT-PCR was stronger in the high-dose group compared with that in the low-dose group,compared with the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Curcumin inhibited HSP27 expression in PC-3 cells may be one mμ echanism of its anti- prostate cancer.

Curcumin;Prostate Cancer;PC-3 cell;Heat shock protein 27

R737.25

A

1673-5846(2015)01-0015-03

牡丹江市第一人民医院泌尿外科，黑龙江牡丹江 157011

黑龙江省中医药科研项目“姜黄素治疗前列腺癌的机制研究”（编号：ZHY13-W62）

徐雷（1978-），主治医师，研究方向：前列腺癌发生机制及生物学研究。E-mail：leixu1978@126.com