朱 勤，刘 骅，武 谷

(安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051)

一次性使用无菌注射器是临床上广泛使用的医疗器械，与血液或人体直接接触，是属于国家重点监管的医疗器械产品之一，与人民医疗健康息息相关。体外细胞毒性试验是一类在离体状态下模拟生物体生长环境，检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的试验，是生物学评价体系中重要的检测指标之一［1］。在对2010年国家监督抽验的8个厂家40批次的一次性使用无菌注射器的生物安全评价中，按照GB/T14233.2-2005的检测方法增加了体外细胞毒性［2］的评价。现将结果报道如下。

1 材料与仪器

超净台(苏州净化设备有限公司 HS-1300)、CO2培养箱(三洋 MCO-15AC)、酶标仪(美国基因公司MQX200R)、倒置显微镜(日本尼康)、小鼠成纤维细胞L-929(购自中科院上海生命科学院细胞库)、RPMI-1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)、小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)、胰酶(北京赛驰生物科技有限公司)、MTT(Sigma公司)。阴性对照为高密度聚乙烯，阳性对照为5% 二甲基亚砜(DMSO)溶液，一次性使用无菌注射器来源于国家监督抽验(8个厂家，2个规格共40批，分别标记为A、B……H厂家)。

2 方法与结果

2.1 样品制备［2］

2.1.1 注射针 在无菌条件下，按照0.2 g·mL－1浸提比例，称取注射针4 g，加入浸提介质(含10%小牛血清的RPMI-1640培养基)20 mL，密封后，置37℃二氧化碳培养箱中孵育24 h。

2.1.2 注射器 在无菌条件下，取同一批号注射器3支，抽取浸提介质至最大刻度线处，置于37℃的二氧化碳培养箱中孵育24 h。

2.2 试验步骤 按照 GB/T14233.2-2005中浸提方法用显微镜观察法和MTT法同时对注射针和注射器分离检测［4－5］。

2.2.1 显微镜观察法 将已培养24～48 h生长旺盛的细胞消化后用含10%小牛血清的培养液配成1×105·mL－1的细胞悬液接种于直径35 mm培养皿内，每皿2 mL。置5%CO2培养箱37℃培养24 h后弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液，每皿各加2 mL，每组平行操作3皿，置5%CO2培养箱37℃继续培养72 h后置显微镜下观察，依据标准规定判定毒性反应级别(见表1)。

2.2.2 MTT 法［6－8］将已培养24 ～48 h 生长旺盛的细胞消化后用含10%小牛血清的培养液配成1×104·mL－1的细胞悬液接种96孔培养板，每孔100 μL。置5%CO2培养箱37℃培养24 h后弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液，每组各设至少6孔，每孔各加100 μL，置5%CO2培养箱37℃继续培养72 h后置显微镜下观察，再每孔加入20 μL质量浓度为5 g·L－1的MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150 μL DMSO，置振荡器上振荡10 min，在酶标仪570 nm和630 nm波长下测定吸光度，按公式计算相对增殖率(RGR)［9］，RGR=(供试品组吸光度/空白对照组吸光度)×100%，依据标准规定判定毒性反应级别。

表1 细胞毒性反应分级

2.3 结果 8个厂家40批次一次性使用注射器检测结果如表2所示。由表2可见，40批注射针的体外细胞毒性均符合要求，但是40批注射器的体外细胞毒性试验中有75%产品符合要求，25%的产品细胞毒性较大，不符合国家标准。

表2 各厂家批次规格注射针和注射器检测结果

3 讨论

本次试验涉及8个厂家共计40批次的样品量，检测结果显示注射针全部符合标准要求，没有体外细胞毒性，有25%注射器有明显的体外细胞毒性，且不同规格均有产品有体外细胞毒性，本次抽验量中5 mL规格批次较多，在同规格中检测结果不合格比率为19%，1 mL规格批次较少，但是在同规格中检测结果不合格比率达到33%，提示今后抽样和检测需要更加关注1 mL规格的注射器品种，统计结果显示如表3，4。

表3 各厂家合格与不合格批次统计

表4 出现不合格批次厂家规格分析统计

本次试验的8个厂家中有两个厂家为国外品牌，均未显示细胞毒性，但是由于抽样量较少，无法体现绝对的参比意义。国内品牌中抽样量也不均一，所以建议在今后的监督抽验中，能够扩大抽样量和抽样范围，尽可能覆盖临床所使用的各种型号和品牌。同时体外细胞毒性的检测结果提示生物安全性试验内容有必要进行扩充。

体外细胞毒性试验符合3R原则，更加有效灵敏并在减少动物损伤的前提下，提供生物安全隐患的参考。而一次性使用无菌注射器在临床治疗中广泛使用，因为涉及到体内给药，有创伤性和开放性以及与血液、体液的直接接触性，所以对于此类医疗器械的质量安全控制尤其需要重视和加强，目前临床医疗事故的发生不能排除医疗器械的潜在危害性未被及时准确的发现，针对患者的生命安全保障的考虑，急需研究更多有效的试验方法来考察和更严格有效的控制一次性无菌注射器的生物安全。在本次国评抽验中发现了部分产品存在体外细胞毒性，也有相关医疗问题曝光，所以建议进一步探索产生体外细胞毒性的原因，避免今后企业在生产中出现问题［10］。

［1］郝和平.医疗器械生物学评价标准实施指南［M］.北京:中国标准出版社，2000:100－101.

［2］何金花，黎毓光，张 鹏，等.原花青素联合Apollon siRNA抑制肝癌HepG2细胞增殖及凋亡［J］.安徽医药，2013，17(4):552 －555.

［3］梁福贵，罗军强，梁汉昌.灯盏花素对肝癌细胞HepG2和正常肝细胞LO-2的体外增殖抑制作用［J］.安徽医药，2012，16(10):1423－1424.

［4］GB/T16886.12-2005，医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品.

［5］GB/T14233.2-2005，医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法.

［6］胡静娜.噻唑蓝法测定香菇多糖体外对癌细胞毒作用［J］.医药导报，2013，32(4):464 －466.

［7］高静贤，王莎莎，金 梦，等.医用超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨［J］.中国医疗器械杂志，2013(3):210－212.

［8］严晓莺，陈巨鹏，王明艳.MTT法检测没食子酸对两种细胞的体外毒性［J］.中医药信息，2012，29(2):107 －109.

［9］赵 斌，葛金芳，朱娟娟.小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法［J］.安徽医药，2007，11(9):834 －836.

［10］伍会灿.国内一次性使用无菌输注器械市场现状及其发展趋势［J］.中国医疗器械信息，2012，18(1):55 －57.