桑婷婷，高晓平，李光武，阮 元

(1.安徽医科大学第一附属医院康复运动科，安徽合肥 230022;2.安徽医科大学神经生物研究所，安徽合肥 230032)

自闭症，又称孤独症，是以社会交往障碍和局限性、刻板性、重复性行为为主要特征，是广泛性发育障碍中最有代表性的疾病之一［1］，其发病率呈逐年上升的趋势。其中社会交往障碍也是自闭症患者达到最终康复目标回归社会的最大阻碍，目前暂无针对性的有效药物。丁香酚精油是由丁香中提取，为其主要活性成分，是一种抗氧化剂，具有调节内分泌、抗抑郁［2］、改善认知［3］等功效。本研究通过观察丁香酚精油通过嗅觉通路对丙戊酸钠(VPA)自闭症模型鼠社交行为的影响，从而进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 自闭症模型制备及评定 健康成年清洁级Sprague-Dawy(SD)雄性(280～300 g)、雌性(220～250 g)大鼠，由安徽医科大学实验动物中心提供，充足水和食物饲养，适应环境1周，依据文献［4］的造模方法，按雌雄比2∶1于下午5时合笼，次日早晨8时行阴道涂片检查是否存在精子，存在时记录为妊娠第1天(E1)，孕鼠分笼饲养，于E12.5 d时给予模型组孕鼠腹腔注射 (VPA)600 mg·kg－1(用生理盐水配成250 g·L－1溶液);对照组给予等量生理盐水(NS)注射。模型组及盐水对照组孕鼠产下仔鼠分别记为 VPA组、NS组;以出生当天为生后第1天(P1)。记录自闭症模型组及对照组发育学情况:P7，P14，P21体重、P12～16睁眼时间，P8、P10、P12、P16 游泳能力及 P7 ～10 趋向能力等行为表现，21 d断奶后适应饲养1周，采用社交实验中社交次数和持续时间的记录评估各组鼠社交情况。参照Schneider［5］，评估发育学及行为学确定造模是否成功。

1.2 社交行为 一个60 cm×40 cm×40 cm的黑色木箱，置于安静的环境内，用40 W红光照明，分别对模型组和对照组大鼠进行检测，要求参与测试的两只鼠来自同一组，不同饲养箱，月龄、性别相同，体质量差距控制在15 g内，观察10 min，记录社交行为次数包括跟随、追逐同伴、嗅生殖器、打斗、趴在鼠身上及头—头接触等发生次数及持续时间，为减少对新环境的不适，实验鼠在实验前2 d放置于检测笼内5 min适应，每天2次;为了激发出更多的社交行为，测试前1 d单独隔离至少3.5 h。

1.3 实验分组和干预方式 选择成功造模的自闭症模型鼠20只，随机分为模型吸嗅组(VPA-E)和模型对照组(VPA-C)。吸嗅方法参考文献［6］，丁香酚溶剂均匀地洒在密闭的实验盒底部，上面放置一带有许多孔的薄铁栏栅。给药时，首先使精油充分挥发，弥漫整个实验盒内，后将实验动物放入，盖上盒盖，吸嗅30 min后取出动物，每天3次，共持续4周。丁香酚、蒸馏水以1∶999浓度配置，吸嗅组给予稀释后丁香酚精油(安徽医科大学神经生物研究所提供)吸嗅，对照组吸嗅清洁空气。

1.4 统计学处理 采用 SPSS16.0统计软件分析，实验数据以±s表示，两组间不同时间点定量数据的比较采用重复测量数据方差分析方法，多组间采用单因素方差分析，多组之间两两比较采用SNK-q检验的方法，计数资料采用秩和检验，以P＜0.05，为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 发育及行为表现情况

2.1.1 发育情况 与NS组相比，VPA组鼠表现为各时间点低体重，差异具有统计学意义 P7［(11.29±1.48)g vs(9.92 ±1.26)g］、P14［(20.71 ±3.05)g vs(13.87 ± 1.86)g］、P21［(37.9 ± 4.88)g vs(30.8 ±2.39)g］，睁眼时间延迟，P12 天两组仔鼠均未睁眼，P13～15自闭症模型组的睁眼情况评分均低于正常组，差异有统计学意义 P13［(0.00±0.00)分 vs(0.41 ±0.69)分］、P14［(0.45 ±0.69)分 vs(1.18 ±0.60)分］、P15［(1.18 ±0.75)分 vs(2.00 ±0.00)分］，P16 时两组仔鼠双眼均已睁眼。

2.1.2 行为表现 VPA组趋向能力实验中转身所用时间较NS组明显增加，差异有统计学意义 P7［(27.09 ±3.96)s vs(18.18 ±3.03)s］、P8［(23.3±5.20)s vs(13.18 ± 2.40)s］、P9［(17.18 ±3.573)s vs(8.6 ±1.80)s］、P10［(14.91 ±3.42)s vs(6.82 ±1.40)s］;游泳能力评分低于正常组，差异有统计学意义 P8［(1.09 ±0.70)分 vs(2.27 ±0.65)分］、P12［(2.45 ±0.52)分 vs(3.45 ±0.52)分］，P10、P16天两组仔鼠游泳能力无差异;社交试验中P28天VPA组仔鼠在接触次数及持续时间上均低于 NS组，P ＜0.05，接触次数［(35.75 ±3.31)次 vs(19.58 ±4.87)次］、持续时间［(64.42 ±6.02)s vs(35.58 ±8.12)s］。

2.2 精油吸嗅后社交行为的变化情况 与NS组相比，VPA-C组接触次数减少明显，接触持续时间明显缩短，差异具有统计学意义(P＜0.05);与VPA-C组相比，VPA-E组接触次数增加，持续时间延长，P ＜0.05。结果见表1，2。

表1 各组大鼠社交行为中接触次数的比较(±s，次)

表1 各组大鼠社交行为中接触次数的比较(±s，次)

注:与 VPA-C 组相比，#P ＜0.05;与 VPA-E 组比较，※P ＜0.05。

组别 N 干预后NS 10 55.41 ±3.23#※VPA-E 10 46.92 ±4.72#VPA-C 10 33.17 ±4.86

表2 各组大鼠社交行为中接触持续时间的比较(±s，s)

表2 各组大鼠社交行为中接触持续时间的比较(±s，s)

注:与 VPA-C 组相比，#P ＜0.05;与 VPA-E 组比较，※P ＜0.05。

组别 N 干预后NS 10 91.00 ±5.41#※VPA-E 10 82.83 ±5.89#VPA-C 10 61.08 ±9.10

3 讨论

丙戊酸钠是目前使用最广泛的一种抗癫痫药物，在双向情感障碍及偏头痛的治疗中也有涉及。然而，VPA也是一种已知的致畸药物，孕期尤其是器官形成期使用可引起胎儿神经发育异常，主要表现为认知功能障碍、行为问题和交流的障碍［7］。动物研究发现在胎鼠的神经管闭合时间内给予孕鼠单VPA干预可引起仔鼠发育及行为学异常，这与自闭症患者临床表现相近。本研究参照Schneider等［4］造模方法制备自闭症动物模型，实验结果显示模型鼠存在明显的发育学及行为学异常。与NS组相比，VPA组表现为低体重，睁眼时间延迟，游泳能力评分低水平，趋向实验中转身所用时间明显延长，社交实验中表现为接触次数的减少及持续时间缩短。与崔利军等［8］的研究结果一致，本实验自闭症模型制备成功，证实VPA动物模型具有重复性好、良好的表面效度。

嗅觉是最原始的感觉之一，参与生物多种行为，如觅食、交流、情感等，其通路在脑内投射范围广泛。气味分子与嗅上皮的特异性G蛋白偶联受体神经元结合产生动作电位，沿轴突传递至嗅球，经嗅觉通路到达情绪相关中枢下丘脑、杏仁核等［9］，产生对气味的感受。杏仁核在社会行为和调整情绪中有着重要的作用，其相关结构的功能紊乱可能参与自闭症的神经病理学［10］。研究表明芳香类物质可通过嗅觉通路，调节自主神经及生理功能［11］;影响脑内神经递质的含量缓解抑郁样症状［2，12］、改善空间学习记忆能力［3］等。所以我们推测芳香物质可通过嗅觉通路改善自闭症的社交行为。本研究以VPA腹腔注射建立自闭症模型，使用丁香酚吸嗅干预VPA大鼠，发现丁香酚吸嗅组社交实验结果明显优于模型组，说明丁香酚吸嗅对VPA大鼠的社交障碍有一定的治疗作用。

5－羟色胺(5-HT)作为人类大脑系统最早开发的神经递质之一，在脑内分布广泛，其神经元胞体多数位于中缝核群，其中起自中缝背核与中缝正中核的纤维，向上投射到下丘脑、杏仁体、海马等脑区。临床研究发现约1/3自闭症患者在发育关键时期存在高5-HT血症［13］，因幼儿早期血脑屏障系统不完善，高水平5-HT可进入脑内［14］，通过负反馈作用抑制自身神经元的发展和靶器官的发育［15］。因此5-HT系统发育异常可能与自闭症患者脑发育异常有关［16］。动物研究中发育早期使用血清素受体激动，幼崽表现出“孤独症样”行为，如社交障碍和刻板重复行为等［17］。非典型抗精神病药可改善自闭症刻板、社交障碍等行为［18］。本实验证实VPA自闭症模型存在社会交往障碍，早期丁香酚吸嗅干预后社交行为有所改善，推测丁香酚通过嗅觉通路调节脑区单胺类神经递质含量，影响靶器官杏仁核及其相关结构的发育，从而改善社交行为。

综述所述，丁香酚精油吸嗅可一定程度上改善VPA自闭症大鼠社交障碍，其具体可能的作用机制需进一步探索。

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