孙露银(综述)，闫彩凤(审校)

(江苏省苏北人民医院内分泌科，江苏 扬州 225001)



壳聚糖促进肠道上皮细胞吸收的机制

孙露银△(综述)，闫彩凤※(审校)

(江苏省苏北人民医院内分泌科，江苏 扬州 225001)

摘要：多肽和蛋白质类药物具有高效、低毒及药物间相互作用小的特性，使得它们越来越多地应用于临床。胃肠道在人体和外界之间形成了一个选择性屏障，允许营养物质、水等通过的同时阻止蛋白和多肽等大分子物质通过。因此，在过去的几十年中，许多科学家致力于口服纳米载体的研究。壳聚糖及其衍生物因具有黏膜黏附力、可逆地打开紧密连接及带有正电荷的特性，已被作为安全有效的肠道吸收促进剂。肠道主要通过跨细胞或细胞旁途径吸收物质，而壳聚糖可促进跨细胞及细胞旁途径的吸收。

关键词：壳聚糖；肠道上皮细胞；吸收机制；紧密连接；通透性

由于胃酸的破坏、消化酶的降解以及难以跨越生物膜的机械屏障作用，蛋白多肽类药物只能以静脉、皮下注射等形式给药，且往往需要长期反复给药，为患者带来极大的不便，因此开发蛋白多肽类药物口服给药系统意义重大。虽然各种载体的应用已经大大提高了蛋白质类药物在胃肠道的吸收能力，但由于各种载体均有其自身局限性，至今仍没有蛋白质的口服制剂上市。为了解决蛋白质类药物的口服胃肠道吸收问题，需要对胃肠道生理结构和吸收机制进一步认识。现以壳聚糖为例，对肠道上皮细胞的吸收机制进行综述，为研发出更好的载体提供理论依据。本研究对壳聚糖促进肠道上皮细胞吸收的机制进行综述。

1吸收途径

大分子物质在肠道的吸收主要通过跨膜运输或者细胞旁途径。空肠、回肠的紧密连接相对疏松及跨膜电阻相对较低，并且小肠绒毛使得其吸收面积明显扩大，因此药物在肠道的吸收主要在小肠远端，即空肠和回肠。而肠上皮细胞层是大分子物质从肠腔吸收进入血液循环的主要屏障。肠上皮细胞层由肠道上皮细胞、M细胞和杯状细胞组成。其中数量最多的为肠道上皮细胞，主要负责营养物质的吸收。其次为杯状细胞，它可以分泌黏液，防止病原体的入侵。 数量最少的为M细胞，主要存在于小肠的远端，回肠的派氏结，它能够从肠腔摄取抗原和微生物，然后提供给潜在的黏膜免疫系统。随着时间的进展，上皮细胞间的结构逐渐细化，并且明确了紧密连接是细胞旁吸收的主要屏障。

1.1跨膜运输物质的跨膜运输方式主要有3种：被动运输、主动运输、胞吞和胞吐。大分子物质，如蛋白质等进行跨膜运输的主要方式为胞吞和胞吐。肠道对纳米药物的摄取可通过胞吞作用，该过程和抗原的摄取相似。蛋白或多肽等大分子物质口服给药易被胃肠道蛋白酶降解。因此，为了提高口服吸收率及生物利用度，许多载体产生了。通过采用纳米粒子的理化性质，如粒径、黏膜黏附能力、大分子的跨膜转运得以增强。并且，纳米粒子的跨膜转运和粒子大小相关，随着离子直径的减小，纳米粒子的跨膜运输增强。粒子直径<100 nm可能被肠上皮细胞吸收，而>500 nm可能被回肠派氏结的M细胞摄取。

1.2细胞旁途径脂溶性药物可通过跨膜途径吸收，而一些大分子亲水药物(如多肽、蛋白质类药物)不能够通过细胞膜的脂质双分子层，因此细胞旁途径成为其吸收的主要途径。细胞旁途径的吸收(即通过上皮细胞间的间隙)受紧密连接制约。紧密连接在机体中起着机械性连接、支持和封固作用,使细胞间联系加强,避免受外力的作用而彼此分离。紧密连接一般围绕着上皮细胞的顶端,呈连续的腰带状分布,与管腔之间形成一个渗透屏障,从而阻止管腔内的物质与细胞间隙内物质的任意互流,使两者均可维持一定的浓度梯度。紧密连接形成一道屏障，允许从肠腔中吸收所需的水和电解质，防止炎症和感染因子等进入全身循环，对于维持机体的稳态有着重要的意义[1]。紧密连接是物质吸收的主要屏障，并且有研究表明，缺乏紧密连接的细胞层基本无屏障功能[2]。紧密连接蛋白claudins(CLDNs)可以分为3类：完整的跨膜蛋白、周边相关的胞质蛋白和信号蛋白[3]。跨膜蛋白包括CLDNs、闭锁蛋白、连接黏附分子，胞质蛋白主要包括闭锁小带蛋白(zona-occluden，ZO)。信号蛋白起着黏附及信号转导的作用，但对上皮细胞的通透性无影响[4-5]。 迄今为止，CLDNs家族有27种[6]，主要决定细胞旁途径吸收的组织、大小、电荷选择性。并且，生理学的证据表明CLDNs对紧密连接的屏障功能起决定性作用[7]。一些实验证明，CLDN-7主要形成紧密连接链[8]；CLDN-1，-3,-4,-5,-8,-11,-14，-19和细胞旁紧密连接的强度有关[9]。CLDN-4,-8,-14为阳离子屏障，而CLDN-2,-7,-10,-13,-15,-16为阳离子和阴离子屏障[2]。值得注意的是，敲除超过90%的ZO-1和ZO-2并不导致紧密连接的断裂[10]，表明只有一少部分的ZO蛋白参与了紧密连接的构成。并且，有研究表明，缺乏ZO-1蛋白，紧密连接不能形成[11]，提示ZO-1蛋白是形成紧密连接的必需部分。

最近的研究已经阐明壳聚糖可以可逆地打开Caco-2细胞间的紧密连接，从而促进药物的吸收[12]。Sonaje等[13]通过镧(电子致密示踪剂)染色展现了壳聚糖对紧密连接的开放。在实验组，可在紧密连接之间及基底侧观察到镧，而在对照组，主要在微绒毛表面观察到镧，表明没有紧密连接开放。以上的结果表明，具有黏膜黏附功能的壳聚糖具有打开紧密连接的能力。

从理论上讲，纳米颗粒的细胞旁转运是不可行的，因为上皮细胞间的间隙在天然状态下为0.3~1 nm，这阻碍了大多数纳米粒子的渗透。即便在紧密连接完全打开的状态，细胞间的间隙最大只有20 nm，这限制了完整的壳聚糖纳米粒的细胞旁途径转运。因此，大分子物质的细胞旁途径的运输有赖于壳聚糖纳米粒的裂解[14]。可能的机制为：壳聚糖纳米粒能够黏附和渗透黏液；渗透的纳米粒变得不稳定且使附近的上皮细胞表面松解，并促进其加载的药物释放。然后，由于壳聚糖介导，上皮细胞间的紧密连接已打开，其负载的药物可进入血液循环。

2促进吸收的机制

2.1电荷依赖性生理状态下，肠腔的pH为弱碱性，因此带有正电荷的物质易被肠道吸收。壳聚糖、多赖氨酸、聚乙烯亚胺等带有正电荷的物质可以使肠道上皮细胞模型的紧密连接打开，并且该过程是可逆的。但是，纳米粒表面电荷对其吸收是否有影响仍有争议。研究表明，和中性或带有正电荷的纳米粒相比，带有负电荷的纳米粒与肠道上皮细胞的亲和力低[15]；而Shakweh等[16]发现的结果恰恰相反。

2.2增加黏膜黏附性增加纳米粒的黏膜黏附能力是增加肠上皮细胞吸收率的有效方法。壳聚糖是一个众所周知的黏膜黏附性聚合物，其黏附性是由于带正电荷的壳聚糖和黏膜表面的带负电荷的唾液酸残基之间的静电作用。这种相互作用可以延长壳聚糖纳米粒同其黏附面的接触时间，从而促进其口服吸收能力。并且，壳聚糖使得药物在胃肠道的滞留时间明显延长，这种黏附特性可促进跨细胞及细胞旁途径的吸收。

2.3紧密连接的打开

2.3.1紧密连接相关蛋白的改变CLDNs同紧密连接的打开密切相关。经壳聚糖处理后，CLDN-4从胞膜到胞质重新分布，接着紧密连接的强度降低，最终使得细胞旁途径的通透性增加[12]。并且，CLDN-1在紧密连接中高表达可使得细胞旁电阻降低，进而增加上皮细胞通透性[17]。有学者研究发现，壳聚糖及其衍生物可诱导Caco-2细胞的肌动蛋白骨架重组[18]的同时，肌动蛋白的其他形态学没有改变。此外，闭锁蛋白、ZO-1蛋白也可能发生了改变。但是，一项关于HT-29/B6细胞模型的研究表明[19]，与Caco-2细胞模型不同，壳聚糖作用于HT-29/B6细胞模型后，大分子物质细胞旁通透性的增加与CLDNs和ZO-1的表达、肌动蛋白骨架的形态学改变无关。随着细胞旁电阻的降低，细胞旁通透性增加，但是具体机制尚不明确。

2.3.2蛋白激酶C(protein kinase C,CPK)激活目前，已发现的PKC亚型至少有10种[20]。通常情况下，PKC参与了紧密连接的打开或裂解，因此PKC的抑制会阻碍膜电阻的降低[21]。而壳聚糖激活了依赖PKC的信号通路，进而影响紧密连接的完整性，从而促进细胞旁转运。但是也有研究表明，PKC亚型不同，对上皮细胞的通透性可能不同，有的甚至相反[22]。

2.4降低电阻物质通过跨细胞途径吸收需要克服跨膜电阻的作用。研究表明，壳聚糖纳米粒可促进肠道的跨膜吸收[23-24]。并且，纳米药物促进跨膜运输的机制是降低肠上皮细胞的跨膜电阻[18-19]。

3毒性研究

在增加肠上皮细胞通透性的同时，是否会增加小肠内毒素的吸收，目前仍是一个有争议的问题。已有研究表明了壳聚糖纳米粒对脂多糖(胃肠道最常见的毒素)吸收的影响。实验结果表明[14]，负载胰岛素的壳聚糖纳米粒可通过上皮细胞进入血液循环，但脂质体却不能透过，是因为阴离子脂质体和带负电荷的黏液层之间的电荷斥力。在体内的毒性研究进一步证实了壳聚糖细胞旁渗透的提高不增加脂多糖吸收。因此，壳聚糖纳米粒子作为口服给药载体前景可观。另一项研究表明[19]，壳聚糖的毒性与其浓度相关，在聚合物浓度为0.005%时，其降低跨膜电阻的力度最强且无毒，浓度<0.001%时，不具备降低跨膜电阻的能力，而浓度为0.01%时则具有细胞毒性。

4结语

肠道上皮细胞即是药物吸收的主要场所，同时也是药物吸收的主要屏障。大分子物质(如蛋白及多肽)主要通过跨细胞或细胞旁途径吸收。增强跨膜运输主要通过降低跨膜电阻、增加黏膜黏附能力等途径。而增强细胞旁途径的运输主要通过紧密连接的打开。紧密连接的打开主要与CLDNs、闭锁蛋白、ZO蛋白的结构和形态学的改变以及PKC的激活有关。通过对这些机制的了解，可以研制出相应的载体，更好地实现药物的控制释放。目前紧密连接的结构尚未能完全阐明，紧密连接的打开机制尚未完全明确，需要更为深入的研究。

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Mechanisms of Chitosan Enhancing Intestinal Epithelium AbsorptionSUNLu-yin，YANCai-feng.(DepartmentofEndocrinology，NorthernJiangsuPeople′sHospital,Yangzhou225001，China)

Abstract:Peptides and proteins featured with high efficiency,low toxicity and small drug interactions,are more and more applied in clinical practice.The gastrointestinal epithelium,forms the boundary between the body and external environment,effectively provides a selective permeable barrier that limits the permeation of peptide and protein,while allowing the appropriate absorption of nutrients and water.Over the past decades,many researchers have developed various nanoparticles for oral delivery systems.Chitosan (CS),a cationic polysaccharide,is widely regarded as a safe and efficient intestinal absorption enhancer of therapeutic macromolecules,owing to its inherent mucoadhesive feature and ability to modulate the integrity of epithelial tight junctions reversibly.The epithelial cells create this selective permeability by two pathways:the transcellular and the paracellular route.As an efficient absorption enhancer and drug carrier,CS increases both transcellular and paracellular transports of macromolecules across the intestinal epithelium.

Key words:Chitosan; Intestinal epithelium; Absorption mechanism; Tight junction; Permeability

收稿日期：2014-12-01修回日期：2015-03-13编辑：薛惠文

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.015

中图分类号：R58；R944

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)20-3686-03