徐君飞，彭太兵，符秋霞，郭姝琼，刘喜情

（怀化学院1.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室；2.生物与食品工程学院，湖南怀化418008）

响应面法优化醇提地瓜藤中总黄酮工艺

徐君飞1，2，彭太兵2，符秋霞2，郭姝琼2，刘喜情2

（怀化学院1.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室；2.生物与食品工程学院，湖南怀化418008）

以地瓜藤中总黄酮的提取量为响应值，采用响应面法，研究不同工艺条件对地瓜藤中总黄酮提取量的影响，优化乙醇提取地瓜藤中总黄酮的工艺条件，提高总黄酮得率.最佳工艺条件为，料液质量体积比1：52 g/mL，乙醇体积分数40%，提取前浸泡50 min，提取温度75℃，提取时间43 min，地瓜藤中总黄酮的提取量为44.16 mg/g，相比水提时总黄酮提取量25.62mg/g，醇提具有时间短、提取效率高等优势.

地瓜藤；总黄酮；乙醇提取；响应面法

地瓜藤味苦、性寒，主要分布于广西、贵州、湖南等地，为苗族常用药材，含有丰富的氨基酸、矿物质、黄酮类化合物，具有清热利湿、活血通络、解毒消肿等作用［1］.

黄酮类化合物是一类具有2－苯基色原酮结构的化合物，广泛存在于植物体内，是许多食品和中药材的有效成分，有抗菌、抗病毒、降糖、降血脂、免疫调节等作用［2－4］.

目前，从不同中药材中提取总黄酮的报道很多，但是，对于地瓜藤中总黄酮的提取工艺研究尚为不多.本文以地瓜藤为研究材料，以乙醇为提取剂，研究提取过程中影响总黄酮提取量的几个因素，通过单因素试验、Plackett－Burman（PB）试验、最陡爬坡试验和中心组合设计（Central Composite Design，CCD）试验，得出乙醇提取地瓜藤中总黄酮的最佳工艺条件.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地瓜藤种植于怀化学院生物园，干燥至恒重，粉碎备用；芦丁购自北京德威钠生物技术有限公司，色谱纯；乙醇及其它药品均为分析纯.

FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机，Eppendorf公司；UV－2450紫外可见分光光度计，日本岛津公司.

1.2 试验方法

1.2.1 地瓜藤中总黄酮提取［5］精确称取2.00 g地瓜藤粉于200 mL烧杯，加入100 mL50%的乙醇溶液，室温搅拌浸泡50 min，升温至60℃搅拌提取50 min，冷却，10 000 rpmin离心3 min，收集滤液于100 mL容量瓶，加50%的乙醇稀释至刻度，得样品液.

1.2.2 单因素试验依次优化料液质量体积比、乙醇体积分数、提取前浸泡时间、提取温度、提取时间等参数［6，7］.

1.2.3 PB试验［8］在单因素试验基础上，以总黄酮提取量为响应值，采用Design－Expert 8.0.6［9］进行二级水平（低水平“－1”，高水平“1”［10］）PB试验，优化料液质量体积比（A）、乙醇体积分数（B）、提取前浸泡时间（C）、提取温度（D）、提取时间（E）5个因素，筛选出对总黄酮提取量影响显著的因素［11］.PB试验因素水平如表1所示.

表1 PB试验因素水平

1.2.4 最陡爬坡试验根据PB试验结果，采用最陡爬坡试验确定影响总黄酮提取量的主要因素的宜变区域［12］.

1.2.5 CCD试验CCD试验可用来评价试验指标与各因素之间一阶、二阶或交互作用的非线性关系［13］.在单因素试验、PB试验、最陡爬坡试验的基础上，选取料液质量体积比（A），提取前浸泡时间（C），提取时间（E）3个对地瓜藤中总黄酮提取效果影响显著的因素，采用Design－Expert 8.0.6进行3因素5水平CCD试验设计，试验因素水平如表2所示.

表2 CCD试验因素水平

1.3 分析检测方法

标准曲线的绘制：采用分光光度法，以芦丁质量浓度（c，μg/mL）为横坐标，吸光度A510nm为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为A＝4.5829c－0.0125，R2＝0.9991.

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液质量体积比对总黄酮提取量的影响按照地瓜藤中总黄酮的提取方法，考察不同料液质量体积比对地瓜藤中总黄酮提取量的影响，结果如图1所示.

图1 不同料液质量体积比对地瓜藤中总黄酮提取量的影响

由图1可以看出，地瓜藤与乙醇溶液的质量体积比小于1：50 g/mL时，地瓜藤中总黄酮的提取量随质量体积比的增大而增大；质量体积比超过1：50 g/mL后，总黄酮的提取量增长缓慢.这可能是由于质量体积比为1：50 g/mL时，地瓜藤中总黄酮的溶出已趋于饱和，再增大地瓜藤与乙醇溶液的质量体积比对总黄酮的溶出帮助不大，且过高的液相浓度将会大大提高生产成本和后续浓缩难度［14］.由此得出，地瓜藤与乙醇溶液的质量体积比，宜选用1：50 g/mL.

2.1.2 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响按照地瓜藤中总黄酮的提取方法，考察不同乙醇体积分数对地瓜藤中总黄酮提取量的影响，如图2.

由图2可以看出，地瓜藤中总黄酮的提取量在选用40%乙醇作溶剂时最大，为37.8 mg/g；乙醇体积分数继续升高，总黄酮的提取量反而快速下降，这可能是由于乙醇体积分数过大，增加了地瓜藤中醇溶性、亲脂性物质的溶出，同时，也降低了总黄酮的提取量，且过高的液相浓度将会大大增加后续目标物质纯化的难度.由此得出，乙醇的体积分数宜选用40%.

2.1.3 提取前浸泡时间对总黄酮提取量的影响按照地瓜藤中总黄酮的提取方法，考察提取前浸泡不同时间对地瓜藤中总黄酮提取量的影响，如图3.

图2 不同乙醇体积分数对地瓜藤中总黄酮提取量的影响

图3 提取前浸泡时间对总黄酮提取量的影响

由图3可以看出，总黄酮提取量随提取前乙醇浸泡时间的延长而稍有增加，但浸泡时间超过50 min后，总黄酮的提取量增长缓慢.这可能是由于地瓜藤在室温条件下，用乙醇浸泡50 min时，总黄酮的溶出率趋于饱和［15］.由此得出，以保证提取效果为前提，为了缩短时间，可选用40%的乙醇浸泡50 min后再提取.

2.1.4 提取温度对总黄酮提取量的影响按照地瓜藤中总黄酮的提取方法，考察不同提取温度对地瓜藤中总黄酮提取量的影响，结果如图4所示.

图4 不同提取温度对总黄酮提取量的影响

由图4可以看出，乙醇溶液温度由40℃升高至75℃，总黄酮的提取量不断增大，当温度为75℃时，总黄酮的提取量最大，达43.6 mg/g，这可能是因为随着乙醇溶液温度的升高，分子热运动加快，提取量不断增大［16，17］，但乙醇的沸点在常压条件下为78℃，故温度再上升不利于实验操作.由此得出，提取温度宜选用75℃.

图5 不同提取时间对总黄酮提取量的影响

2.1.5 提取时间对总黄酮提取量的影响按照地瓜藤中总黄酮的提取方法，考察不同提取时间对地瓜藤中总黄酮提取量的影响，如图5.

由图5可以看出，乙醇提取时间由20 min延长至40min，总黄酮的提取量不断增大，当提取时间为40 min时，总黄酮的提取量达到最大，为44.1 mg/g，继续延长提取时间，提取量迅速下降，这可能是由于提取时间过长，总黄酮在长时间高温条件下结构破坏、分解，且长时间高温提取耗能大，杂质溶出量大［16，17］.由此得出，乙醇提取时间宜选用40 min.

2.2 PB试验

按照PB试验设计，共进行12次试验，其中6个空白因素［18］，每个试验号重复3次，取均值.试验方案及结果见表3.

表3 PB 试验设计及响应值

用Minitab l7［19］对表3中结果进行回归模型方差分析，如表4.

表4 回归模型方差分析

由表4可以看出，PB试验结果的回归拟合方程P＝0.000＜0.05，具有统计学意义.

并且该回归拟合方程的R2＝0.965，调整后的R2＝0.936，相关系数高，这说明此变异可以用模型来解释.

PB试验结果拟合所得回归拟合方程的回归方程系数显著性检验结果见表5.

表5 回归方程系数显著性检验表

由表5可以看出，影响地瓜藤中总黄酮提取量的主要因素为料液质量体积比（A）、提取前浸泡时间（C）、提取温度（D）、提取时间（E），且影响顺序为料液质量体积比（A）＞提取温度（D）＞提取时间（E）＞提取前浸泡时间（C）.回归得到多元一次方程为：Y＝22.02＋7.63A＋1.83C＋4.45D－2.63E.

2.3 最陡爬坡试验

以试验值的变化方向为爬坡方向，对料液质量体积比（A）、提取前浸泡时间（C）、提取时间（E）进行最陡爬坡试验.根据表5中因素估计系数，确定A，C两个因素为正效应，应依次增大，E因素为负因素，应依次减小；根据各因素效应值与比例确定变化步长［20］.

最陡爬坡试验设计方案及结果详见表6.

表6 最陡爬坡试验设计及结果

从表6可以看出，随着爬坡的进行，Y值—总黄酮的提取量不断增加；在处理3处达到最大，之后开始缓慢下降，这说明在点3对应的条件下，地瓜藤中总黄酮提取量接近最优，因此，可以选择这一点作为CCD试验设计的中心点.

2.4 CCD试验

2.4.1 CCD试验设计及结果选取料液质量体积比（A）、提取前浸泡时间（C）、提取时间（D）3个因素，做3因素5水平响应面分析，设计共20个试验点，其中14个析因点，6个中心点（以最陡爬坡试验的最优值为中心点［21］），设计方案及结果如表7.

表7 CCD试验设计方案及结果

2.4.2 回归模型方差分析利用Design expert 8.0.6对 CCD试验设计结果进行回归拟合，并对其模型的系数显著性进行分析，如表8；对其模型进行方差分析，结果如表9.

表8 回归系数显著性检验表

由表8可以看出，在一次项中，料液质量体积比（A）对总黄酮的提取量的影响达到了显著水平，在二次项中，料液质量体积比（A）、提取时间（E）对总黄酮的提取量的影响都达到了显著水平.回归拟合后得到多元一次方程为：Y＝44.11＋0.82A＋0.15C＋0.29E－0.48A2－0.18C2－0.51E2.

表9 回归方程方差分析结果

从表9可以看出，回归方程的F＝4.77＞F0.01（9，5），P＝0.0114＜0.05，表明该回归方程模型达到显著水平.失拟检验分析得失拟不显著，表明该回归方程模型无失拟因素存在，与实测值能较好地拟合.

该回归方程模型的相关系数R2为0.8110，校正后R2为0.9145，这表明采用此方法进行地瓜藤中总黄酮的提取，其91.45%的变异分布在方程中，仅8.55%的变异不能由该模型解释.

Y值—总黄酮的提取量的变异系数为1.47，相对较低，这表明该试验的精确度高，可靠性强，操作可信.

综上所述，该回归方程给地瓜藤中总黄酮的乙醇浸提提供了一个合适的模型.

2.4.3 最佳工艺参数的确定及验证试验通过Design expert8.0.6，得出乙醇浸提地瓜藤中总黄酮的优化工艺条件为：地瓜藤与40%乙醇质量体积比1：52 g/mL，常温浸泡50min，升温至75℃，提取43min，此时总黄酮的理论提取量为44.2 mg/g.为检验结果的可靠性，采用上述优化工艺条件提取地瓜藤中总黄酮，进行3次平行试验，结果表明，在此条件下，每g地瓜藤中总黄酮的平均提取量为44.16 mg/g，与预测值一致，这说明此模型方程与实际情况拟合良好，由响应面法优化所得乙醇浸提地瓜藤中总黄酮的工艺条件具有实际

参考价值.

3 结论

通过单因素试验、PB试验、最陡爬坡试验、CCD试验对乙醇浸提地瓜藤中总黄酮的工艺条件进行优化，得出地瓜藤与40%乙醇质量体积比1：52 g/mL，常温浸泡50 min，升温至75℃，提取43 min的工艺条件下，总黄酮提取量为44.16 mg/g，相比水提时总黄酮提取量为25.62 mg/g，醇提具有时间短、提取效率高等优势.

地瓜藤的开发进度缓慢，已经造成了大量资源浪费，对于其中活性成分的深入研究，必定为地瓜藤的开发研究提取基础理论数据和参考依据.地瓜藤的广泛开发应用，前景广阔，可大大推动地方经济发展，产生更大的经济效益与社会效益.

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Optim ization of Ethanol Extraction of Total Flavonoids from Ficus Tikoua Bur.by Response Surface Methodology

XU Jun-fei1，2，PENG Tai-bin2，FU Qiu-xia2，GUO Shu-qiong2，LIU Xi-qing2
（1.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources；2.College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua，Hunan 418008）

The optimization of ethanol extraction conditions of total flavonoids in Ficus tikoua Bur.by response surface methodology is to improve the yield.Based on the single－factor test analysis，the Plackett－Burman experimental design and steepestascent design，while taking extracted amount of total flavonoids as the response value，response surface method was applied to analyze the influence of various factors and their interaction on the extraction of total flavonoids，an optimized progress was selected to extract total flavonoids in ficus tikoua Bur.The optimal ethanol extraction conditions of total flavonoids are solidliquid ratio 1：52（g/mL），ethanol concentration 40%，soak time 50 min，extraction temperature 75℃，extraction time 43 min.Under these conditions，total flavonoids yield reached 44.16 mg/g.

ficus tikoua bur.；total flavonoids；ethanol extraction；response surfacemethodology

Q657.3

A

1671－9743（2015）11－0001－06

2015－08－01

湖南省重点建设学科经费资助（2011－42）.

徐君飞，1981年生，女，湖南邵阳人，讲师，博士，研究方向：农产品加工.