湖南产石菖蒲和水菖蒲挥发油成分分析和抑菌活性检测

2015-12-08刘清茹田小娟李顺祥

中成药 2015年12期

关键词：石菖蒲菖蒲挥发油

李娟，刘清茹，肖兰，谢谦，田小娟，李顺祥*

（1.湖南中医药大学，湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心，湖南长沙410208；2.长沙卫生职业学院药学系，湖南长沙410100）

湖南产石菖蒲和水菖蒲挥发油成分分析和抑菌活性检测

李娟1，2，刘清茹1，肖兰2，谢谦2，田小娟2，李顺祥1*

（1.湖南中医药大学，湖南省中药活性物质筛选工程技术研究中心，湖南长沙410208；2.长沙卫生职业学院药学系，湖南长沙410100）

目的研究湖南产石菖蒲和水菖蒲挥发油的成分组成和体外抑菌活性。方法水蒸气蒸馏法提取挥发油，GCMS法分析其成分组成，平皿打孔和数学级试管稀释法测定其体外抑菌活性。结果在石菖蒲挥发油中鉴定出41个化合物，主要为甲基胡椒酚（45.06%）、顺式异丁香酚甲醚（35.51%）、β-细辛醚（9.38%）和长叶松烯（1.50%）；在水菖蒲挥发油中鉴定出46个化合物，主要为β-细辛醚（16.58%）、蓝桉醇（14.38%）、水菖蒲酮（10.81%）、去羟基异菖蒲烯二醇（9.33%）、9-柏烷酮（8.07%）和喇叭烯氧化物（6.99%）。两者体外均对除绿脓杆菌外的7种供试菌表现出明显的抑制作用，并且后者对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的抑制作用强于前者。结论湖南产石菖蒲和水菖蒲挥发油的成分和抑菌活性均有较大差异，在实际应用中应加以区分。

石菖蒲；水菖蒲；挥发油；抑菌活性；GC-MS

菖蒲为天南星科菖蒲属植物，始载于《神农本草经》，被列为上品，民间常用其防病祛疫［1］。在我国资源丰富，迄今已发现7个品种和2个变种，分别是水菖蒲、石菖蒲、长苞菖蒲、金钱蒲、茴香菖蒲、香叶菖蒲、宽叶菖蒲、细根菖蒲（水菖蒲变种）及金边菖蒲（石菖蒲变种）［2］，历代本草［3-4］主要以水菖蒲和石菖蒲为药材来源。现代研究表明，两者富含挥发油，具有多种生物活性，尤其是在抑菌作用方面［5-8］。湖南是石菖蒲和水菖蒲的主产地之一，但这两种药材中挥发油成分的差异较大［9-10］，本实验采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析其成分组成，并通过平皿打孔和数学级试管稀释法测定其体外抑菌活性，为合理利用和开发湖南产菖蒲属植物提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料 GCMSQP2010 GC-MS联用仪（日本岛津公司）；SW-CJ-1B超净工作台（苏州净化设备有限公司）；WAC-47全自动高压灭菌锅（北京勤业永为科技有限公司）；303-0S型电热恒温培养箱（上海康路仪器设备有限公司）。

普通营养琼脂（肉汤）培养基（杭州微生物试剂有限公司）；无菌脱纤维羊血（北京陆桥技术股份有限公司）；明胶十六烷三甲基溴化胺培养基（上海源叶生物科技有限公司）。乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为分析纯。

石菖蒲和水菖蒲于2012年11月采自湖南浏阳大围山，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott和水菖蒲Acorus calamus L.。将这两种药材洗净，除去泥砂，取根茎，阴干，备用。

金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、绿脓杆菌ATCC27853、表皮葡萄球菌ATCC1228、痢疾志贺氏杆菌ATCC25931、白假丝酵母菌ATCC10231和乙型溶血性链球菌ATCC32210均购自南京便诊生物科技有限公司；幽门螺杆菌由中南大学湘雅医院范学工教授赠送。

1.2 挥发油提取将石菖蒲和水菖蒲药材粉碎成粗粉，分别称取200 g，置于2 000 mL圆底烧瓶中，加6倍量蒸馏水浸泡2 h，自冷凝管上端加水至充满挥发油测定器的刻度部分，加热至沸，保持微沸6 h，冷却后收集挥发油，即得。石菖蒲挥发油为无色透明油状物，收率1.8%；水菖蒲挥发油为淡黄色透明油状物，收率2.1%，分别用无水硫酸钠脱水，密封保存。

1.3 GC-MS分析条件［11］

1.3.1 气相色谱条件 RTX-5MS弹性石英毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25μm）；采用柱程序升温，初始温度为60℃，以4℃/min的速率升至220℃，保持5 min，再以10℃/min的速率升至240℃；进样口温度250℃，载气为氦气（纯度99.999%）；柱内载气体积流量1.0 mL/min；柱前压130.0 kPa；分流比30∶1；进样量1μL。

1.3.2 质谱条件 EI离子源；电子能量70 eV；扫描范围35～550 amu；离子源温度200℃；接口温度260℃；倍增器电压1.0 kV。

1.4 体外抑菌实验

1.4.1 供试品溶液制备取石菖蒲和水菖蒲挥发油适量，加入DMSO，无菌水溶解，即得质量浓度为100 mg/mL的供试品溶液（DMSO终浓度为0.5%）。

1.4.2 培养基制备普通营养琼脂（肉汤）培养基用于培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和痢疾志贺氏杆菌；往里另加入8%脱纤维羊血用于培养乙型溶血性链球菌；Skirrow血琼脂培养基用于培养幽门螺杆菌；明胶十六烷三甲基溴化胺培养基用于培养绿脓杆菌；沙堡氏培养基用于培养白假丝酵母菌。

1.4.3 抑菌活性测定采用改良打孔法［12］，分别定量移取供试液50μL，DMSO溶液为阴性对照，每个样品重复6次。细菌在37℃培养箱中培养24 h（幽门螺杆菌用37℃微需氧环境［85%N2、10%CO2、5%O2］中培养72 h），真菌在28℃下培养48 h后，测量抑菌圈两个垂直方向的直径，以评价不同样品的抑菌活性。然后，采用数学级试管稀释法测定挥发油的MIC，每管液体培养基中分别加入不同浓度的挥发油，使其终浓度分别为0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg/mL，各管最终总容量为1 m L。另设加等量不含任何药物的M-H液体培养基作为正常对照，含菌不含药的M-H液体培养基作为阳性对照。各实验管中分别加入浓度为2×107cfu/mL的各菌株对数生长期新鲜培养物0.1 mL，同法培养后，以培养基中没有细菌生长的最高稀释度为MIC，确定抑菌浓度范围。

2 实验结果

2.1 挥发油成分分析按上述实验条件对石菖蒲和水菖蒲挥发油进行GC-MS分析，样品总离子流图见图1和图2，再采用面积归一化法测定各成分的相对含有量，各色谱峰相应的质谱图经计算机检索及人工解析质谱，并与标准谱图［13-14］比对。结果，从石菖蒲挥发油中分离得到51个色谱峰，鉴定出41个化合物，占挥发油总量的99.50%，主要为甲基胡椒酚（45.06%）、顺式异丁香酚甲醚（35.51%）、β-细辛醚（9.38%）、长叶松烯（1.50%）等；从水菖蒲挥发油中分离得到71个色谱峰，鉴定出46个化合物，占挥发油总量的93.98%，主要为β-细辛醚（16.58%）、蓝桉醇（14.38%）、水菖蒲酮（10.81%）、去羟基异菖蒲烯二醇（9.33%）、9-柏烷酮（8.07%）、喇叭烯氧化物（6.99%）、1-异丙基-4，8-二甲基螺［4.5］癸-8-烯-7-酮（4.58%）等，详见表1。

图1 石菖蒲挥发油总离子流图

图2 水菖蒲挥发油总离子流图

表1 湖南菖蒲属植物挥发油的成分分析

续表1

2.2 挥发油抑菌活性石菖蒲和水菖蒲挥发油对上述8种供试菌的抑菌圈直径存在很大差异，抑菌活性结果见表2，MIC值见表3。

表2 石菖蒲和水菖蒲挥发油的抑菌活性比较（抑菌圈直径，n=6）

表3 石菖蒲和水菖蒲挥发油抑菌的M IC值

由表2可知，石菖蒲和水菖蒲挥发油均对除绿脓杆菌外的7种供试菌株表现出明显的抑菌活性，但抑菌能力和范围存在差异。两者对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的抑菌作用均明显强于革兰

阴性菌大肠埃希菌和痢疾杆菌，对幽门螺杆菌和白假丝酵母菌也均有较强的抑制作用，但对大肠埃希菌和痢疾志贺氏杆菌的抑菌活性均较弱。其中，后者对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的抑菌作用明显强于前者（P＜0.05）。

由表3可知，石菖蒲和水菖蒲挥发油对这7种供试菌株的MIC在0.3～0.8 mg/mL之间。其中，两者对大肠埃希菌、痢疾志贺氏杆菌、白假丝酵母菌和幽门螺杆菌的MIC均分别为0.80、0.80、0.50和0.40 mg/m L，并且后者对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌（MIC分别为0.40、0.30和0.30 mg/mL）的抑制作用强于前者（MIC分别为0.50、0.40和0.40 mg/mL）。

3 讨论

在植物形态方面，石菖蒲叶自根茎丛生，无中脉，而水菖蒲植物体较大，根茎比石菖蒲粗，叶有明显的中脉；在药材性状方面，石菖蒲粗节似蜈蚣，扁曲分枝色灰棕，气香油点环鲜明，而水菖蒲根茎粗壮少分枝，断面海绵筋脉点，浓烈异香带泥腥［15-16］；在化学成分方面，比较表1中石菖蒲和水菖蒲挥发油成分的组成，发现两者差异较大；在抑菌活性方面，虽然两者对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、幽门螺杆菌、白假丝酵母菌、大肠埃希菌和痢疾杆菌均表现出抑菌活性，但后者对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的抑菌作用强于前者。综上所述，石菖蒲和水菖蒲在植物形态、药材性状、化学成分和抑菌活性等方面均有明显不同，因此，在实际应用中应加以区分。

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R284.1

1001-1528（2015）12-2778-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.048

2015-02-25