孙 艳， 李 娜， 陆 颖， 余圆圆， 陈 钧

（江苏大学药学院，江苏镇江212013）

大蒜素与盐酸小檗碱联用体外抗菌试验

孙 艳， 李 娜， 陆 颖， 余圆圆， 陈 钧*

（江苏大学药学院，江苏镇江212013）

目的 研究大蒜素联合盐酸小檗碱对临床常见菌及耐药菌的抗菌效果。方法 采用微量肉汤稀释法测定供试药物对4个常见菌，2个标准菌，和2个耐药菌的最小抑菌浓度 （MIC），微量棋盘稀释法和时间—杀菌曲线法评价两药对各试验菌株的联合作用。结果 当两药单独应用时，其MIC值范围分别为大蒜素156.25（敏感株） ～1250（耐药株）μg/mL，盐酸小檗碱78.125（敏感株）～312.5（耐药株）μg/mL。当两药联合应用时，部分抑菌浓度指数 （FICI）值为0.75～1，为相加作用。从24 h时间—杀菌曲线可以发现，当两药单独应用时，即使在4×MIC下，也未能显示杀菌效应，而联用时在相对较低质量浓度下显示出杀菌作用；还显示出在低于MIC下具有弱协同 （敏感株）或者相加作用 （耐药株）。结论 大蒜素和盐酸小檗碱联合应用，具有良好的抗菌作用。

大蒜素；盐酸小檗碱；抗菌；协同作用

大蒜素（diallyl trisulfide，DATS），为百合科葱属植物大蒜中的一种有机硫化合物，在熟大蒜中含有量较高［1-3］。它具有广谱的抗菌［4］、 抗真菌［5］、抗衣原体、抗支原体和抗病毒［6］等作用。目前，大蒜素胶囊已用于临床治疗由病毒和细菌感染的疾病。盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，BBH），为小檗科植物中一种天然的异喹啉类生物碱，具有广谱抗菌作用［7］，其片剂和胶囊一直应用于临床。我国古代经典中医药学著作 《普济本事方》记载有 “治脏毒，蒜连圆。鹰爪黄连末，用独头蒜一颗，煨香烂熟，研和入臼，治圆如梧子大。陈米饮下。此药神妙”处方。该处方用于治疗脏毒 （即肠道感染性疾病），按照现代研究，该方剂的主要药效成分为大蒜素和盐酸小檗碱［8-10］。

现代公共卫生面临的问题之一是耐药菌及其引起的慢性感染性疾病。而目前尚未见该处方的两种主要成分大蒜素和盐酸小檗碱联合应用时的抗耐药菌活性研究，故本试验进行了大蒜素和盐酸小檗碱抗六种肠道病原菌的活性研究，并重点进行了抗产超广谱内酰胺酶大肠埃希菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性研究。

1 实验材料与仪器

1.1 供试药物 大蒜素 （DATS，批号20131129，江苏正大清江制药有限公司）；盐酸小檗碱（BBH，批号20140115，南京春秋生物科技有限公司）；注射用硫酸链霉素 （批号120418，山东鲁抗医药股份有限公司）；注射用青霉素钠 （批号S120705，山东鲁抗医药股份有限公司）。

1.2 试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853（镇江市疾病预防控制中心）；溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、肺炎克雷伯菌（Klebisella pneumoniae）、产超广谱内酰胺酶大肠埃希菌（producing extended-spectrum beta-lactamases E.coli，ESBLs）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）（江苏大学附属江滨医院病理科）。

1.3 主要试剂及仪器 SPX-250B型生化培养箱（上海跃进医疗器械厂）；SHZ-88型水浴恒温震荡器（江苏省金坛市医疗器械厂）；SW-CJ 2FD双人单面净化工作台 （苏州净化设备有限公司）；TG328A电子分析天平（德国Sartorius公司）；LSB50L型立式压力蒸汽灭菌器 （江苏省金坛市医疗器械厂）；96孔微量板 （美国Coring公司）；可调式移液枪（美国Thermo electron corporation）。

吐温-20（批号20140603，国药集团化学试剂有限公司）；氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC，上海试剂三厂）；MHB、MHA培养基 （南京森贝伽生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 供试药液的制备 大蒜素溶液的制备：以20%的吐温-20为溶剂，配置10 mg/m L的大蒜素溶液。盐酸小檗碱试剂：以无菌水为溶剂，配置5 mg/mL的盐酸小檗碱溶液。硫酸链霉素、青霉素钠溶液的制备：以生理盐水为溶剂，配置1 280 U/m L的溶液。

2.2 菌悬液的制备 将各试验菌株接种于MHA培养基上，37℃活化培养增菌18～24 h，取单个菌于MHB培养基上，37℃培养18～24 h。用灭菌生理盐水调整浊度至0.5麦氏（约为1.5×108CFU/ mL），备用。

2.3 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）的测定 采用标准微量肉汤稀释法［11］，分别测定大蒜素与盐酸小檗碱对几种试验菌株的MIC值。在灭菌96孔平底微量板上，第1列每孔加入100μL供试药液和100μL的MHB培养基，混匀后，取第1列中药液100μL加入到第2列每孔，与第2列每孔中加入100μL的MHB培养基混匀后，从第2列中取100μL加入第3列，依次按照液体的2倍稀释法将已制备的大蒜素及盐酸小檗碱溶液分别稀释至5～0.039 06 mg/mL和2.5～0.019 53 mg/m L。同时做溶剂对照，注射用硫酸链霉素和注射用青霉素钠做阳性药物对照。加入已调至约1.5×106CFU/mL的各试验菌株的菌悬液

10μL，最后的接种量控制在1.5×105CFU/mL。在37℃下，培养18～24 h。然后，每孔加入0.25%TTC 5μL，继续培养2 h。用肉眼观察培养孔，呈现红色为有菌生长，在阴性溶剂对照的前提下，判断供试样品是否具有抗菌活性，记录结果。每次试验重复3次。

采用TTC判定MIC的原理［12］，即TTC可被活菌细胞内的琥珀酸脱氢酶等呼吸酶，还原成不溶性的红色甲臜颗粒，使活菌呈现红色，以鉴别菌体细胞活性。鉴于在常规操作下，中药天然产物实际已不能完全正确地反映样品的抑菌能力，本研究采用TTC对菌体染色，鉴别菌体细胞活性，以不能显示的质变范围来判读抑菌效果，保证实验结果的准确性和可靠性。

2.4 微量棋盘稀释法 采用微量棋盘稀释法，测定大蒜素和盐酸小檗碱两药联合的抗菌效果。在96孔平底微量培养板上，以二维棋盘的纵向 （A～H）和横向 （1～12）两个方向，根据两药单用时对试验菌株的MIC值（分别记为MICa和MICb），将两药分别以4×MIC～1/16×MIC的质量浓度联合应用。加入已制备的1.5×106CFU/mL的菌悬液10μL，至最终菌悬液为1.5×105CFU/mL。在37℃下，培养18～24 h。然后，每孔加入0.25% TTC 5μL，继续培养2 h。用肉眼观察培养孔，呈现红色为有菌生长。每次试验重复3次。考察每一种药物联用时的MIC（分别记为MICA和MICB），通过计算部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI），FICI=MICA/MICa+ MICB/MICb，判断两药体外药效学相互作用：FICI≤0.5时，两药为协同作用；0.5＜FICI≤1时，两药为相加作用；1＜FICI≤2时，两药为无关作用；FICI＞2时，两药为拮抗作用［13-14］。

2.5 24 h时间—杀菌曲线法 采用时间—杀菌曲线试验［15］，对大肠埃希菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、ESBLs及MRSA单独应用时的杀菌效果及联合应用时的杀菌作用效果进行考察。以各试验菌株的MIC值的实验结果为依据，将两药分别稀释为1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC和2×MIC。加入已制备的1.5×108CFU/mL的菌悬液至最终菌悬液为1.5×105CFU/mL。在37℃下振荡培养。然后，于0、1、2、4、8、12、24 h取10μL菌悬液按10倍倍比稀释，取100μL稀释液均匀涂布于MHA平板上。37℃培养18～24 h后进行菌落计数。以时间点为横坐标，以不同时间点生长的菌落数的对数为纵坐标绘制时间杀菌曲线。每次试验重复3次。

两药联合时间—杀菌曲线，将两药分别稀释为1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC和2×MIC，各取2.5 mL置于试管中，使最终药物体积为5 mL。加入已制备的1.5×108CFU/m L的菌悬液至最终菌悬液为1.5×105CFU/mL。在37℃下振荡培养。然后，于0、4、8、12、24 h取10μL菌悬液按10倍倍比稀释，取100μL稀释液均匀涂布于MHA平板上。37℃培养18～24 h后进行菌落计数。以时间点为横坐标，以不同时间点生长的菌落数的对数为纵坐标绘制时间杀菌曲线。每次试验重复3次。

根据文献报道，通过比较两药联用时在24 h的菌落数log10CFU/mL与单药应用时抑菌活性最好的药物在24 h的菌落数log10CFU/mL之差ΔLC24［16］：ΔLC24≥2，协同作用；1≦ΔLC24＜2，相加作用；-1≦ΔLC24＜1，无关作用；ΔLC24＜-1，抵抗作用。同时，用两药联用时24 h的菌落数log10CFU/mL与0 h的菌落数log10CFU/mL之差≥3或者＜3判断两药联用为抑菌作用或者杀菌作用［17］。

3 结果

3.1 MIC值及微量棋盘稀释法 实验结果显示，注射用硫酸链霉素和注射用青霉素钠对大肠埃希菌（ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）的MIC值为20 U/mL和2.5 U/m L，与文献报道类似［18］。大蒜素对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC值分别为156.25、625、625μg/mL，盐酸小檗碱的 MIC值分别为 156.25、78.125、156.25μg/m L（表1）。当两药联用时其FICI值为0.75、1、0.75，显示为相加作用。大蒜素对革兰氏阴性菌大肠埃希菌 （ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌的MIC值分别为156.25、312.5、156.25μg/mL，盐酸小檗碱的MIC值分别为156.25、156.25、312.5μg/mL。当两药联用，都为相加作用 （表2）。对产超广谱内酰胺酶大肠埃希菌 （ESBLs）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），大蒜素联合盐酸小檗碱具有相加的抑菌作用 （表3）。

实验结果显示，当两药联用时对所有试验菌株表现出良好的相加抑菌效果。同时，由表1～3可知，硫酸链霉素对耐药菌ESBLs的MIC值为质控菌大肠埃希菌（ATCC 25922）的32倍，而在相同的条件下大蒜素为2倍，盐酸小檗碱为1倍；青霉素钠对耐药菌MRSA的MIC值为质控菌金黄色葡萄球菌 （ATCC 29213）的128倍，然而在相同的条件下大蒜素为2倍，盐酸小檗碱为1倍。所以，大蒜素及盐酸小檗碱比阳性药物对耐药菌的抑制作用强［19］。

表1 大蒜素及盐酸小檗碱对革兰氏阳性菌的抗菌作用Tab.1 An tibacterial effects of DATS and BBH against gram-positive bacterium

表2 大蒜素及盐酸小檗碱对革兰氏阴性菌的抗菌作用Tab.2 Antibacterial effects of DATS and BBH against gram-negative bacterium

表3 大蒜素及盐酸小檗碱对耐药菌的抗菌作用Tab.3 Antibacterial effects of DATS and BBH against drug-resistance bacterium

3.2 24 h时间—杀菌曲线 大蒜素对大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、ESBLs及MRSA的24 h时间—杀菌曲线随着剂量的增加，呈现出剂量依赖特性 （图1）。盐酸小檗碱对4株菌株也显示了相同的剂量依赖性 （图2）。大蒜素和盐酸小檗碱在细菌生长的24 h内，对前4 h细菌生长有明显的抑制作用，说明大蒜素和盐酸小檗碱对对数生长期的细菌有抑制作用。但是，当大蒜素及盐酸小檗碱单独应用时，在4×MIC下对4株试验菌株在培养至24 h时不能看出抑菌或者杀菌效果，这种抑菌趋势与文献报道类似［20］。

当两药联用时，随着两药质量浓度的增加，出现杀菌效果：对大肠埃希菌 （ATCC 25922），1× MIC BBH+1×MIC DATS在8 h时引起细胞死亡达到杀菌效果；对金黄色葡萄球菌 （ATCC 29213），1×MIC BBH+1×MIC DATS在8 h时也引起细胞死亡达到杀菌效果；对ESBLs，1×MIC BBH+2× MIC DATS在12 h时也引起细胞死亡达到杀菌效果；对MRSA，2×MIC BBH+1×MIC DATS在12 h时也有相同的杀菌效果 （图3）。此外，两药联用在24 h点时，1/4×MIC BBH+1/2×MIC DATS对大肠埃希菌（ATCC 25922）相对于抑菌活性较强的单药下降2.57 log10CFU/mL，为协同作用；1/4×MIC BBH+1/2×MIC DATS对金黄色葡萄球菌 （ATCC 29213）相对于抑菌活性较强的单药下降2.06，为协同作用；1/2×MIC BBH+ 1/4×MIC DATS对ESBLs相对于较抑菌活性较强的单药下降1.86，为相加作用；1/4×MIC BBH+ 1/2×MIC DATS对MRSA相对于抑菌活性较强的单药下降1.08，为相加作用 （图4）。

4 讨论

综上所述，由于抗生素的滥用等导致很多细菌耐药，给人类健康造成了严重的威胁。细菌耐药及耐药菌所引起的一系列慢性疾病，成为了现代公共卫生面临的问题之一。寻找低毒有效的抗菌药物是医药研究关注的焦点。目前，由于许多中草药成分具有低毒且温和的抗菌效果，同时还能够逆转耐药菌的耐药性，从中草药中寻找抗菌药物成为了热点［21］。大蒜素及盐酸小檗碱是从天然药物中发现的两种药物，具有广谱抗菌作用并且已用于临床。

文献报道［22］，盐酸小檗碱对革兰氏阳性菌及耐药菌有良好的抑菌效果，本研究与其相符。同时结果显示，大蒜素对革兰氏阴性菌有良好的抑菌效果。此外，有报道显示［23］，大蒜素对幽门螺旋杆菌被膜的杀菌作用是通过其挥发性和脂溶性，穿透细菌的细胞生物膜，从而破坏和摧毁其细胞［24］。可以发现大蒜素和盐酸小檗碱这两种化合物，一种

为脂溶性挥发性硫醚，一种为水溶性生物碱，在理化性质上有互补的作用。此外，大蒜黄连丸这一古方在我国古代已成功应用，大蒜素和盐酸小檗碱为其主要的成分，我们推测认为将两药联合可能提高其抗菌活性，这是我们探索研究本课题的目的。

图1 大蒜素对试验菌株的时间—杀菌曲线 （，n=3）Fig.1 Time-k ill curves of DATS against tested strains（，n=3）

图2 盐酸小檗碱对试验菌株的时间—杀菌曲线 （，n=3）Fig.2 Time-k ill curves of BBH against tested strains（，n=3）

图3 大蒜素与盐酸小檗碱联合的时间—杀菌曲线 （，n=3）Fig.3 Time-kill curves of DATS and BBH in combination against tested strains（，n=3）

图4 大蒜素与盐酸小檗碱单独及联合的时间—杀菌曲线 （，n=3）Fig.4 Time-kill assay of the two drugs alone and in combination against tested strains（，n=3）

研究表明，单独应用大蒜素及盐酸小檗碱对试验菌株具有抑菌活性，但即使达到4×MIC，在24 h培养下没有显示杀菌作用。然而两药联用时，在24 h培养下以相对较低质量浓度显示出杀菌作用，且在亚MIC下具有弱协同或者相加的联合作用。

本研究采用棋盘法及24 h杀菌曲线法评价两药联用效应时，得出的结果基本一致，个别处略有不同。这是由于两种评价方法在算法上不一致所致［25］。

总之，本研究显示大蒜素和盐酸小檗碱联合应用时对供试的敏感菌株及耐药菌株（ESBLs及MRSA）显示出了较好的杀菌作用。此外，本研究还需要进行更多的临床耐药菌株抑菌试验及其体内药效评价。

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In vitro antibacterial activity of allicin in combination w ith berberine hydrochloride

SUN Yan， LINa， LU Ying， YU Yuan-yuan， CHEN Jun*

（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212O13，China）

AIM To study the in vitro activity of allicin（dially trisulfide）in combination with berberine hydrochloride to common and drug-resistant bacteria.METHODS The broth dilution method was used to test individualminimal inhibitory concentrations（MIC）of four common，two control and two resistent bacteria.The checkerboard dilution and time-kill curve tests were performed on antibacterial synergy effects.RESULTS The MIC of allicin were in the ranges of 156.25（sensitive bacteria）and～1250μg/m L（drug-resistant bacteria）；the MIC of berberine hydrochloride were in the ranges of78.125（sensitive bacteria）and～312.5μg/mL（drugresistant bacteria）.The fractional inhibitory concentration index（FICI）of allicin plus berberine hydrochloride

allicin（diallyl trisulfide）；berberine hydrochloride；antibacterial effect；synergism

R966

A

1001-1528（2015）12-2589-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.004

2015-02-13

孙 艳 （1990—），女，硕士生，研究方向为天然产物活性成分筛选及应用。Tel：18261931810，E-mail：yansun901020@ 126.com

*通信作者：陈 钧 （1947—），男，博士生导师，教授，研究方向为生物活性成分和新药开发以及生物资源有效成分的分离与应用。Tel：13812461762，E-mail：shchen@ujs.edu.cn

ranged from 0.75 to 1.24 h time-kill curve assay showed no bactericidal activity against all test strains even with 4×MIC used alone.However，when used together under the same concentrations，they showed bactericidal activity with synergy and additional effects.CONCLUSIONS The experimental data reveal that the combination of allicin and berberine hydrochloride havemoderate antibacterial effect.