紫金透骨喷雾剂的皮肤刺激性、过敏性、急性毒性研究

2015-12-08侯靖宇谢玉敏王爱民李勇军

中成药 2015年12期

罗媛，侯靖宇，谢玉敏，朱迪，王爱民，李勇军，黄勇*

（1.贵州省骨科医院药剂科，贵州贵阳550004；2.贵阳医学院药学院贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004；2.贵阳医学院民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳550004）

罗媛1，2，侯靖宇2，谢玉敏2，朱迪2，王爱民3，李勇军3，黄勇2*

目的评价紫金透骨喷雾剂皮肤用药的安全性。方法采用豚鼠进行皮肤刺激性试验，观察用药后全身状况及局部皮肤的变化；采用豚鼠进行主动过敏性试验，观察紫金透骨喷雾剂是否引起豚鼠皮肤或全身过敏性反应；采用日本大耳白兔进行急性毒性试验，观察完整皮肤及破损皮肤多次接受受试药物所产生的急性毒性反应。结果紫金透骨喷雾剂对豚鼠和日本大耳白兔完整皮肤无刺激作用，对破损皮肤有轻度可逆的刺激性反应；对豚鼠无皮肤过敏反应；对日本大耳白兔皮肤未见急性毒性反应。结论紫金透骨喷雾剂皮肤局部用药安全性良好。

紫金透骨喷雾剂；刺激性；过敏性；急性毒性；安全性

紫金透骨喷雾剂处方源于贵州黔西南州中医院经验方，由紫金莲、透骨香、白及、松节油和冰片5味我省地产草药组成，具有活血散瘀、消肿止痛、舒筋通络之功效，临床以酒剂外用于治疗跌打损伤、扭伤、关节肿痛等症，具有坚实的临床应用基础。课题组在充分发挥我省天然药物资源优势和继承传统中药特色基础上，采用现代制剂提取技术富集有效成分，将其研制成了现代中药喷雾剂，具有方便携带、速效、给药剂量准确、药物的稳定性好等特点。药理作用研究表明，紫金透骨喷雾剂能明显减轻软组织损伤的水肿程度，减少瘀血面积，具有明显的消炎、镇痛作用，能一定程度上改善血液流变学，促进局部微循环，可用于治疗急性闭合性软组织损伤［1-2］。为进一步考察其安全性，参照《中药、天然药物研究技术指导原则》（2005年版）和相关文献［3-15］，进行了紫金透骨喷雾剂皮肤刺激性、过敏性和急性毒性研究，并对该药进行客观评价，为临床使用提供理论依据。

1 材料

1.1 供试药紫金透骨喷雾剂（贵阳医学院贵州省药物制剂重点实验室，规格30 mL/瓶，批号20130318）；2，4-二硝基氯代苯（上海化学试剂有限公司，批号020711）。

1.2 动物豚鼠，体质量300～350 g，雌雄兼用，雌性无孕。日本大耳白兔，体质量1.8～2.2 kg，雌雄兼用，雌性无孕。均由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK（黔）2002-0001。

1.3 组别及剂量设置

1.3.1 皮肤刺激性试验设置高、中、低3个剂量给药组及对照组。给药组用药剂量分别为0.6 g生药/（kg·d）、0.3 g生药/（kg·d）、0.15 g生药/（kg·d）3个剂量。

剂量设置：紫金透骨喷雾剂拟推荐的临床成人用法用量为，皮肤局部给药，每日5 mL，成人体质量按60 kg计算，折合0.025 g生药/（kg·d）。所设剂量相当于成人日用药剂量的24、12、6倍。

配制方法：本品0.3 g生药/mL，组间剂量比设置为1∶2。为保证足够的给药剂量，高剂量组采取以原药液2 mL/（kg·次）-1的方式进行。则3个剂量组的配制方法为：高剂量组，原药液直接使用（临床给药剂量），给药剂量为0.3 g生药/mL×2 mL/kg=0.6 g生药/kg；中剂量组，取原药液，以75%乙醇（紫金透骨喷雾剂溶媒）稀释为1/2使用，给药剂量为0.3 g生药/kg；低剂量组，取原药液，以75%乙醇稀释为1/4使用，给药剂量为0.15 g生药/kg；溶媒对照组为75%乙醇。

1.3.2 皮肤过敏性试验设置溶媒对照组（75%乙醇）、受试物组（紫金透骨喷雾剂原药液）、阳性对照组（1%2，4-二硝基氯代苯溶液）。

1.3.3 急性毒性试验设置给药组（紫金透骨喷雾剂原药液）及对照组（蒸馏水），给药组用药剂量为3 g生药/（kg·d）。

2 方法

2.1 皮肤刺激性试验［3-8］取豚鼠48只，雌雄各半，于给药前小心剪尽动物背部左右两侧被毛，去毛区为4 cm×

4 cm，去毛后24 h，检查去毛皮肤是否因去毛而划破，如皮肤受伤，该豚鼠不宜用作完好皮肤的刺激性实验。将豚鼠分为完整皮肤和破损皮肤受试组，破损皮肤组用灭菌针尖将去毛消毒皮肤划破，以轻微渗血为度，布满整个去毛区。将完整皮肤和破损皮肤组分别分为3个剂量组给药，每组8只。按各组剂量给药，对照组与给药组采用同体左右侧自身对比法，均右侧涂以药物，左侧涂等量75%乙醇，用药后用纱布和胶带覆盖固定。各组动物均于24 h后去除覆盖物，用清水洗去残留受试物。单次给药组动物仅给予1次；多次给药组动物每天给药1次，连续7 d。单次给药组动物于去除受试物1、24、48和72 h；多次给药组动物于每天给药后24 h、末次给药后1、24、48和72 h，去除受试物，肉眼观察并记录涂药部位有无红斑、水肿等反应。结果参照文献［5-8］进行皮肤刺激反应及刺激强度评分。上述各组动物均在单次或多次给药试验结束后，取给药局部皮肤组织，甲醛固定，HE染色后进行光镜检查。

2.2 主动皮肤过敏试验［3，8-12］取豚鼠24只，雌雄各半，于给药前24 h小心剪尽动物背部左右两侧被毛，去毛区为4 cm×4 cm，试验前随机分为3组，每组8只：溶媒对照组（75%乙醇）、紫金透骨喷雾剂受试物组（原药液）及阳性对照组（1%2，4-二硝基氯代苯溶液），每组8只。实验分两步进行。

第一步，致敏接触：各组豚鼠左侧去毛皮肤上分别给予0.2 m L受试物溶液，并使其分布均匀。给予药物后，用纱布和胶带覆盖固定，确保使供试品与皮肤接触6 h，温水洗去受试药物。第7天和第14天重复接触致敏。

第二步，激发接触：末次接触致敏后14 d，在豚鼠右侧去毛皮肤上按上法分别涂抹0.2 mL各组供试品激发接触，阳性对照药用0.1%的2，4-二硝基氯代苯溶液，同上法操作。6 h后去除供试品，温水洗去受试药物，即刻观察，并于24、48、72 h再次观察有无皮肤红斑、水肿等过敏反应指征。结果参照文献［8，10-12］进行评价。

2.3 局部皮肤给药急性毒性试验［3，9，13-15］取兔24只，雌雄各半，试验前24 h将动物背部以电剪去毛，去毛面积约为15 cm×10 cm，并随机分为破损皮肤和完整皮肤两组。破损皮肤组动物试验，以75%乙醇消毒脱毛区皮肤，然后用消毒刀片划出 “#”型伤口，伤口占满脱毛区，深度以皮肤轻度渗血为度，完整皮肤组动物皮肤应保持完好无损。

采用24 h内4次的给药方式（每次2.5 mL/kg），受试药物直接以最大剂量（原药液）和最大给药容积给予（10 mL/kg，每次分量涂抹防止流淌，保证药液充分作用于给药皮肤局部，然后用消毒纱布和网孔尼龙绷带固定），对照组给予等量蒸馏水，给药后保证药液均匀分布于整个去毛区。给药前用无菌纱布蘸温水擦拭皮肤残留药物。24 h后温水擦净皮肤残留药物，观察1、24、48、72 h直至14 d动物的毒性反应和死亡情况，记录各组动物的一般生理状况、行为活动、眼和黏膜的变化、呼吸、中枢神经系统、体质量、进食、大小便等有否中毒表现和死亡情况；观察涂药皮肤给药局部有无红斑、水肿等反应，参照文献［5-8］进行皮肤刺激反应及刺激强度评分。试验结束后将动物处死进行大体解剖学检查。

3 结果

3.1 皮肤刺激性试验实验结果表明单次、多次给紫金透骨喷雾剂后，完整皮肤各剂量组评分均为 “0”；对破损皮肤，3个剂量平均反应分值在1 h均大于0.5，但低于2.99，表明本品对破损皮肤有轻度刺激性。单次给药后24 h后，刺激性明显消退，平均反应分值均小于0.5，各剂量组给药后48 h刺激性消失，观察结果见表1。多次给药后24 h后，中、低剂量组刺激性明显消退，平均反应分值均小于0.5，各剂量组给药后48 h刺激性消失。观察结果见表2。溶媒对照组均未表现出刺激性。

3.2 主动皮肤过敏试验紫金透骨喷雾剂及溶媒对照组豚鼠激发接触72 h内观察，皮肤无红斑及水肿现象出现，其反应级数平均值为0，致敏率均为0；阳性对照组红斑、水肿和致敏率在72 h内表现为不同级别反应指征。结果见表3。

3.3 局部皮肤给药急性毒性试验观察14 d内动物死亡情况和全身中毒表现。试验期内无一动物死亡，观察发现各给药组动物无异常表现［13］；紫金透骨喷雾剂最大耐受量给药皮肤刺激反应试验中，完整皮肤各剂量组评分均为“0”，破损皮肤的平均反应分值在1 h内表现出中度刺激性，给药后24 h后，刺激性明显消退，表现为轻度刺激性，72 h后刺激性完全消失。溶媒对照组均未表现出刺激性。结果见表4～6。

表1 单次给药皮肤刺激反应实验评分结果（n=8）

表2 多次皮肤刺激反应实验评分结果（n=8）

表3 皮肤过敏实验评分结果（n=8）

表4 完整皮肤最大耐受量给药体质量及死亡情况（n=3）

表5 破损皮肤最大耐受量给药体质量及死亡情况（n=3）

表6 最大耐受量给药皮肤刺激反应试验评分结果（n=3）

4 讨论

本实验均参照《中药、天然药物研究技术指导原则》和相关文献［3-9］进行，结果证实紫金透骨喷雾剂对豚鼠和日本大耳白兔完整皮肤无刺激性、对破损皮肤有可逆的轻微刺激性作用，对豚鼠无皮肤过敏反应。在局部给药急性毒性预试验时，为保证足够的受试剂量，紫金透骨喷雾剂已达到最大剂量和给药容积，故预试验中未测出LD50，仅以最大给药量3 g生药/（kg·d）-1进行试验测定，相当于临床日用量的120倍，这提示本品毒性较低；并且通过观察动物短期内接触本品，亦可见其无皮肤急性毒性。说明紫金透骨喷雾剂是一种安全性较高的外用制剂，临床用于治疗气滞血瘀型急性闭合性软组织损伤，局部肿胀、刺痛，关节活动受限等症是安全的。

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