张 杰， 胡天宇， 沈国亮， 杨 阳， 顾正兵*

（1.江苏永健医药科技有限公司，江苏 泰州225300；2.中国药科大学制药工程系，江苏南京211198；3.东南大学成贤学院，江苏南京210088）

穿山龙中原薯蓣皂苷杂质的分离与鉴定

张 杰1， 胡天宇2， 沈国亮1， 杨 阳3， 顾正兵1*

（1.江苏永健医药科技有限公司，江苏 泰州225300；2.中国药科大学制药工程系，江苏南京211198；3.东南大学成贤学院，江苏南京210088）

目的 对穿山龙Dioscorea nipponica Makino中原薯蓣皂苷所含杂质的化学成分进行研究。方法 从穿山龙提取物中得到原薯蓣皂苷粗品，再采用大孔吸附树脂、制备HPLC法进行分离纯化，并根据理化性质和波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果 从中分得3个杂质，经鉴定分别为黄山药皂苷H（dioscoreside H，1）、原纤细薯蓣皂苷（protogracillin，2）和26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（26-0-β-D-glucopyranosyl-［25R］-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl｛1→4｝-β-D-glucopyranoside，3）。结论 化合物1和3为首次从穿山龙中分离得到。

穿山龙；原薯蓣皂苷；黄山药皂苷H；原纤细薯蓣皂苷；26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷

安全性是药物在整个研发、生产和制作过程中的核心内容，而药品中的杂质则是其质量控制、安全性和毒副作用评价的重点，它涉及到药学研究的方方面面。《中国药典》2010版规定，任何影响药品纯度的物质均称为杂质［1］。其中，化药的杂质主要来源于合成过程中的副产物和未反应完全的物料等，各国药典均有严格的质量标准，而中药的杂质主要来源于分离纯化的原药材，由于其成分的多样性和复杂性，相关分析研究及质量控制比化药难度更大，重视程度也相对欠缺，并且 《中国药典》2010版对其暂未有明确的规定。

原薯蓣皂苷为穿山龙Dioscorea nipponica Maki-

no的主要活性成分之一，属于水溶性甾体皂苷，现代研究表明，它具有增强男性性功能、降血脂、抗癌、抗白血病等较强的药理作用，有着良好的应用前景［2-6］。在前期，我们已研发出一条从穿山龙药材中分离得到高纯度原薯蓣皂苷的优化工艺路线，并申请了专利［7］。在此基础上，为了对原薯蓣皂苷原料的质量加以控制，以及后续对其深入的开发应用，本实验对其中微量杂质成分进行系统研究。在上述专利工艺路线指导下，以原薯蓣皂苷原料为对照，运用现代分离技术，从穿山龙药材中分离、富集和纯化目标杂质成分，最终得到3个化合物。经波谱解析，分别鉴定为黄山药皂苷H（dioscoreside H，1）、原纤细薯蓣皂苷（protograllin，2）和26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（26-0-β-D-glucopyranosyl-（25R）-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl（1→4）］-β-D-glucopyranoside，3），并通过色谱和光谱分析确定这3个化合物即为该原料中的杂质成分，见图1。色谱条件为Kromasir C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-水（27∶73）；柱温为35℃；体积流量为1.0 mL/min；进样体积为20μL；漂移管温度为104℃；气体体积流量为2.8 L/min。

图1 化合物1～3和原薯蓣皂苷原料的色谱图Fig.1 Chromatograms of compounds 1-3 and protodioscin raw material

1 仪器与试药

Varian INOVA-400核磁共振仪，TMS为内标（美国瓦里安公司）；Waters Delta Prep 4000制备型、Waters 1525分析型高效液相色谱仪 （美国Waters公司）；Q-Tof质谱仪（美国Agilent Technologies公司）；ELSD-UM5000蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）。甲醇、乙腈均为色谱纯 （德国Merck公司）；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

穿山龙药材购自安徽省亳州市药材市场，经嘉兴学院医学院王峻副教授鉴定为穿山龙Dioscorea nipponica Makino的根茎。原薯蓣皂苷原料为实验室自制，经面积归一化法测定，其纯度大于98%。

2 提取与分离

取干燥的穿山龙药材100 kg，粉碎后过3号筛，10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.18，静置后取上清液，经AB-8吸附树脂柱层析 （柱体积为250 L），依次用水和20%乙醇分别洗脱3个和5个柱体积。然后，合并20%乙醇部分，减压浓缩至相对密度为1.28，分3次经反相MPLC柱层析（柱体积为10 L），依次用5%、28%、40%乙醇分

别洗脱1、4、5个柱体积，液相跟踪检测后，得到6个流份（Fr.1～Fr.6）。其中，Fr.2主要含原薯蓣皂苷粗品，将其减压浓缩，上制备液相柱 （100 mm×250 mm，10μm），依次用25%、32%、70%乙腈洗脱，液相跟踪检测后合并目标流份，根据其情况 （主要是颜色）采用制备液相色谱仪与树脂色谱柱 （100 mm×250 mm，10μm）分离，从而得到纯品，再经HPLC柱层析（100 mm×250 mm，10μm）处理。结果，在乙腈-水 （25∶75、29∶71、32∶68）条件下，分别得到化合物1（263.4 mg）、2（375.4 mg）、3（305.4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，Liebermann-Burchard、Molish及Ehrlish反应均呈阳性，香草醛反应显黄色，提示为呋甾皂苷类化合物，并且酸水解检出葡萄糖和鼠李糖。ESI-MS m/z：1 069.2［M+Na］+、1 045.4［M-H］-、899.2［M-H-146］-、753.2［MH-146-146］-、737.7［M-H-146-162］-、591.3［M-H-146-146-162］-，表明含有1个葡萄糖和2个鼠李糖，分子量为1 046，分子式为C51H82O22。1HNMR（400 MHz，C5D5N）δ：0.64（3H，s，H-18），1.66（3H，s，H-21），0.95（3 H，s，H-19），1.06（3H，d，J=5.6 Hz，H-27），4.66（1H，d，J=6.8 Hz，H-1 of 26-0-Glc），4.72（1H，d，J=6.4 Hz，H-1 of Glc［inner］），5.24（1H，brs，H-6），5.65（1H，brs，H-1 of Rha［1→4］），6.19（1H，brs，H-1 of Rha［1→2］），1.63（3H，d，J=4.8 Hz，H-6 of Rha［1→2］），1.48（3H，d，J=4.8 Hz，H-6 of Rha［1→4］）。将其13C-NMR谱数据与文献 ［6］报道的伪原薯蓣皂苷比较，发现其C-23位碳信号向低场位移了30.3（α效应），C-24位向低场位移了10.9（β效应），而C-25位向高场位移了0.6（γ效应），表明C-23位上有羟基取代，受其影响，C-20和C-22的化学位移也稍有变化，分别为104.9和154.4。在HMBC谱中，δH1.06（H-27）与δC39.7（C-24）、31.0（C-25）、75.5（C-26）均有明显相关，进一步确定其羟基连在C-23上。此外，δH1.66（CH3-21）与 δC64.9（C-17）、104.9（C-20）、154.4（C-22）也均有远程相关，表明双键连接在C-20和C-22上。以上所有13C-NMR谱数据见表1，而且与文献 ［8］报道基本一致，鉴定为黄山药皂苷H（dioscoreside H），其结构见图2。

化合物2：白色粉末，Liebermann-Burchard、 Molish及Ehrlish反应均呈阳性，香草醛反应显黄色，提示为呋甾皂苷类化合物，而且酸水解检出葡萄糖和鼠李糖。ESI-MS m/z：1 087.1［M+Na］+、1 062.9［M-H］-、916.5［M-H-146］-、754.4［MH-146-162］-、738.2［M-H-162-162］-、592.2［M-H-162-146-162］-、430.4［M-H-162-146-162-162］-，表明含有3个葡萄糖和1个鼠李糖，分子量为1 064，分子式为C51H84O23。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：0.79（3H，s，H-18），0.88（3H，d，J=6.0 Hz，H-27），0.96（3H，s，H-19），1.22（3H，d，J=6.4 Hz，H-21），4.81（1H，d，J=7.2 Hz，H-1 of 26-0-Glc），5.24（1H，brs，H-6），4.79（1H，d，J=7.2 Hz），4.96（1 H，d，J=7.8 Hz），5.10（1H，d，J= 7.0 Hz），6.38（1H，s），1.62（3H，d，J=6.0 Hz，H-6 of Rha［1→2］）。以上所有13C-NMR谱数据见表1，然后用β-D-葡萄糖苷酶对其进行酶解，得到纤细薯蓣皂苷和β-D-葡萄糖。以上数据与文献 ［9］报道基本一致，鉴定为原纤细薯蓣皂苷（protograllin），其结构见图2。

Fig.2 化合物1～3的结构Fig.2 Structures of com pounds1-3

化合物3：白色粉末，Liebermann-Burchard、Molish及Ehrlish反应均呈阳性，香草醛反应显黄色，提示为呋甾皂苷类化合物，而且酸水解检出葡萄糖和鼠李糖。ESI-MS m/z：925.1［M+Na］+、

901.1［M-H］-、755.1［M-H-146］-、593.2［MH-146-162］-、431.2［M-H-162-146-162］-，表明含有2个葡萄糖和1个鼠李糖，分子量为902，分子式为C45H74O18。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：0.80（3H，s，H-18），0.89（3H，d，J=6.4 Hz，H-27），0.83（3H，s，H-19），1.21（3H，d，J= 6.8 Hz，H-21），5.21（1 H，brs，H-6），4.82（1H，d，J=7.2 Hz，H-1 of Glc［inner］），4.79（1H，d，J=7.5 Hz），5.72（1H，brs，H-1 of Rha［1→4］），1.59（3H，d，J=6.4 Hz，H-6 of Rha［1→4］）。以上所有13C-NMR谱数据见表1，并且与文献［10-11］报道基本一致，鉴定为26-0-β-D-吡喃葡萄糖基-（25R）-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ，26-三醇-3-0-［α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）］-β-D-吡喃葡萄糖苷（26-0-β-D-glucopyranosyl-［25R］-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl｛1→4｝］-β-D-glucopyranoside），其结构见图2。

表1 化合物1～3的13C-NM R谱数据（400 MHz，C5D5N）Tab.113C-NMR data of com pounds1-3（400 M Hz，C5D5N）

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版二部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录204，205.

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Isolation and identification of the im purities of protodioscin in Dioscorea nipponica M akino

ZHANG Jie1， HU Tian-yu2， SHEN Guo-liang1， YANG Yang3， GU Zheng-bing1*

（1.Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Taizhou 2253OO，China；2.Department of Pharmaceutical Engineering，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China；3.Chengxian College，Southeast University Nanjing 21OO88，China）

AIM To investigate the chemical constituents of impurities in protodioscin extracted from Dioscorea nipponica Makino.METHODS Raw protodioscin was obtained from D.nipponica extract，which was isolated and purified bymacroporous adsorption resin and preparative HPLC column.Then the structures of isolated compoundswere identified on the basis of physicochemical properties and spectroscopic data.RESULTS Three impurities were isolated and identified as dioscoreside H（1），protogracillin（2）and 26-0-β-D-glucopyranosyl-（25R）-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl（1→4）］-β-D-glucopyranoside（3）. CONCLUSION Compounds 1 and 3 are isolated from Dioscorea nipponica Makino for the first time.

Dioscorea nipponica Makino；protodioscin；dioscoreside H；protogracillin；26-0-β-D-glucopyranosyl-（25 R）-furost-5-en-3β，22ξ，26-triol-3-0-［α-L-rhamnopyranosyl（1→4）］-β-D-glucopyranoside

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2682-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.024

2015-04-28

张 杰 （1987—），男，硕士，研究方向为中药分析和天然药物化学。Tel：15116327288，E-mail：13478536926@163.com

*通信作者：顾正兵，男，博士，研究方向为天然药物化学。Tel：（0523）80183620，E-mail：zbg@youging.com