周丽娟， 申明慧， 李 敏， 殷婷婷， 孙晓燕， 曹 巍*

（1.郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心，河南 郑州450007；2.郑州大学附属郑州中心医院药学部，河南郑州450007）

HPLC法测定蒺藜防白缓释滴丸中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和欧前胡素

周丽娟1， 申明慧1， 李 敏2， 殷婷婷2， 孙晓燕1， 曹 巍1*

（1.郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心，河南 郑州450007；2.郑州大学附属郑州中心医院药学部，河南郑州450007）

目的 采用高效液相梯度洗脱法测定蒺藜防白缓释滴丸 （蒺藜、防风、白芷、当归等）中升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷和欧前胡素的含有量。方法 蒺藜防白缓释滴丸甲醇提取液分析在Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）上实施；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm。升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的色谱流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～10 min，15%A；10～20 min，15%→30%A；20～25 min，30%A）；柱温35℃。欧前胡素的色谱流动相为甲醇-水 （68∶32，V/V）；柱温30℃。结果 升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷分别在1.602 0～112.14μg/mL（r=0.999 8）、1.396～139.60μg/mL（r=0.999 9）范围内与峰面积成良好的线性关系，平均回收率分别为100.2%（RSD=0.99%）和99.9%（RSD=0.80%）。欧前胡素在0.707 2～70.72 μg/m L（r=0.999 9）范围内与峰面积成良好的线性关系，平均回收率为99.4%（RSD=1.0%）。结论 本法操作简便，准确可靠，可用于蒺藜防白缓释滴丸的质量评价。

蒺藜防白缓释滴丸；升麻素苷；5-0-甲基维斯阿米醇苷；欧前胡素；高效液相色谱法

sode；imperatorini；HPLC

蒺藜防白丸是我院医疗机构制剂，多年来用于治疗白癜风，临床疗效肯定，使用安全。其组方由蒺藜、防风、白芷、当归、赤芍、丹参、补骨脂、墨旱莲、枸杞子、菟丝子、黄芪、豨莶草、甘草和何首乌 （制）14味药材组成，在此基础上开发研究成蒺藜防白缓释滴丸，鉴于质量标准中以薄层色谱对蒺藜进行了鉴别，故不测定蒺藜有效成分。防风和白芷是方剂中的主要成分，本实验采用HPLC梯度洗脱法［1-3］对防风中的升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷，白芷中的欧前胡素［4-6］进行了测定，为该药的制剂工艺和质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AUW-120D电子分析天平 （日本岛津公司）；ML303E分析天平 （梅特勒托利多仪器上海有限公司）；TQX-150 AH超声波清洗器（山东新华医疗器械股份有限公司）；80-2台式低速离心机（上海医疗器械有限公司）。

蒺藜防白缓释滴丸 （自制，批号分别为140315、140320、140322、140324）；升麻素苷（批号111522-201310，纯度95%）、5-0-甲基维斯阿米醇苷 （批号111523-201208，纯度96.4%）、欧前胡素（批号110826-201214，纯度99.5%）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈为色谱纯（Merck公司）；水为miliQ超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的测定［7-8］

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱 （0～10 min，15%A，10～20 min，15%→30%A，20～25 min，30%A）；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm；柱温35℃；进样量10μL。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取升麻素苷对照品8.43 mg和5-0-甲基维斯阿米醇苷对照品7.24 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为贮备液。精密量取贮备液1 m L，置10 m L量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，另精密量取5 mL，置10 m L量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液 （含升麻素苷40.050μg/mL、含5-0-甲基维斯阿米醇苷34.900μg/m L）。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 取蒺藜防白缓释滴丸20丸，研细，混匀，精密称取0.8 g，置10 mL量瓶中，加80%甲醇适量，超声处理 （功率120 W、频率40 kHz）30 min溶解，放冷，加80%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2.3 阴性样品溶液的制备 取除去防风药材的蒺藜防白缓释滴丸组方，按提取工艺提取后，在“2.1.2.2”项下方法制备空白溶液，即得。

2.1.2.4 空白辅料干扰 取制备滴丸的处方量空白辅料，同法制成空白辅料测定液。

2.1.3 系统适用性试验 取 “2.1.2”项下制备的对照品和供试品溶液、阴性样品、空白辅料溶液，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定。结果，升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷理论塔板数分别为9 255和186 019，两峰之间及和其他色谱峰均能达到良好分离，R均大于1.5，空白溶液不干扰测定，见图1。

2.1.4 线性关系试验 分别精密量取“2.1.2.1”项下的对照品贮备液2.0、1.4、1.0、0.8、0.5 m L，分别置于10 m L量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取对照品溶液2.8、2.0、1.0、0.4 mL，分别置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成含升麻素苷160.20、112.14、 80.100、 64.080、 40.050、 11.214、8.010 0、4.005 0和1.602 0μg/mL，含5-0-甲基维斯阿米醇苷139.60、97.720、69.800、55.840、34.900、13.960、6.980 0、3.490 0和 1.396 0 μg/mL的溶液。在上述色谱条件下进样测定，分别以升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度（C）对各自的峰面积 （A）进行线性回归，计算回归方程，见表1。

2.1.5 最低检测限和定量限 分别取 “2.1.4”项下最低浓度的溶液，加甲醇依次稀释进样测定。当S/N≥10时，升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷最低定量限分别为0.163 ng、0.138 ng；当S/N≥3时，最低检测限分别为 0.065 ng、0.055 ng。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s

表1 升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的回归方程、相关系数、线性范围Tab.1 Resgression equations，correlation coefficients and linearity ranges of prim-O-glucasylcim ifugin and 5-O-methylvisamm iosode

2.1.6 精密度试验 取对照品溶液，重复进样测定6次，升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的RSD分别为0.57%和0.49%。

2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8 h，进样测定，升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的RSD分别为0.41%（n=6）和0.32% （n=6）。

2.1.8 回收率试验 取成分含有量已知的滴丸，按 “2.1.1.2”项下方法，取供试品约0.8 g，共9份，各精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加80%甲醇适量。在9个样品中，分别加入含升麻素苷（180.6μg/m L）的对照品溶液0.6、0.8、1.0 mL，各3份，再分别精密加入5-0-甲基维斯阿米醇苷 （60.72μg/m L）的对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，超声处理 （功率120 W、频率40 kHz）30 min，放冷，加80%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按上述色谱条件进样测定，计算升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的回收率。结果见表2。

表2 升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests for prim-O-glucasylcim ifugin and 5-O-methylvisamm iosode

2.1.9 重复性试验 精密称取滴丸 （140315）6份，按 “2.1.2.2”项下方法制成供试品溶液，分别进样测定，计算每丸中升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷的总含有量为0.034 1 mg，RSD为1.39%。

2.2 欧前胡素的测定

2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相甲醇-水（68∶32，V/V）；体积流量1.0 mL/min；检测波长254 nm；柱温30℃；进样量10μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取欧前胡素对照品8.88 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为贮备液 （353.6μg/m L）。精密量取贮备液1 m L，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液（35.36μg/mL）。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取蒺藜防白缓释滴丸20丸，研细，混匀，精密称取0.8 g，置10 mL量瓶中，加90%甲醇适量，超声处理 （功率120 W、频率40 kHz）30 min，放冷，加90%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性样品的制备 取除去白芷药材的蒺藜防白缓释滴丸组方，按提取工艺提取后，按“2.2.2.2”下方法制备空白溶液，即得。

2.2.2.4 空白辅料 同“2.1.2.4”项下制得的空白辅料测定液。

2.2.3 系统适用性试验 取 “2.2.2”项下对照品和供试品溶液、阴性样品、空白辅料溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。结果，欧前胡素理论塔板数为14 718，阴性样品成分不干扰测定，前后杂质与欧前胡素分离度分别为2.31和1.55，见图2。

图2 欧前胡素测定的HPLC图谱Fig.2 HPLC ch romatogram s for im peratorin

2.2.4 线性关系试验 分别精密量取 “2.2.2.1”项下对照品贮备液2.0、1.0、0.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取对照品溶液1.0、0.5、0.2 mL，分别置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成含欧前胡素70.720、35.360、17.680、3.536 0、1.768 0、0.707 2μg/m L的溶液。按上述色谱条件进样测定，以欧前胡素的质量浓度 （C）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程A=40.008 C+ 3.709 5（r=0.999 99，n=6），欧前胡素在0.707 2～70.72μg/mL范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.2.5 最低检测限和定量限 分别取 “2.2.4”项下最低浓度的溶液，加甲醇依次稀释进样测定，

当S/N≥10时，定量限为1.77 ng；当S/N≥3时，最低检测限为0.47 ng。

2.2.6 精密度试验 取对照品溶液，重复进样测定6次，结果RSD为0.39%。

2.2.7 稳定性试验 取供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8 h进样测定，结果欧前胡素RSD为0.32% （n=6）。

2.2.8 回收率试验 取成分含有量已知的滴丸，按 “2.2.2.2”项下方法制备样品9份，分别精密量取70.72μg/mL欧前胡素对照品溶液1.2、1.5、2.0 m L，各3份，分别加入9份样品溶液中，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算欧前胡素回收率。结果见表3。

表3 欧前胡素回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests for imperatorini

2.2.9 重复性试验 精密称取滴丸 6份，按“2.2.2.2”项下方法制成供试品溶液，分别进样测定，计算每丸中含欧前胡素 0.005 59 mg，RSD=1.2%。

2.3 样品测定 取3批样品，在“2.1.1”项升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷、“2.2.1”项欧前胡素色谱条件下测定本品，结果见表4。

表4 含有量测定结果 （，n=3）Tab.4 Results of content determ ination（，n=3）

表4 含有量测定结果 （，n=3）Tab.4 Results of content determ ination（，n=3）

批号 升麻素苷/（mg·丸-1）5-0甲基维斯阿米醇苷/（mg·丸-1）欧前胡素/（mg·丸-1）140320 0.032 2 0.002 27 0.005 80 140322 0.032 7 0.002 24 0.005 68 140324 0.031 9 0.002 31 0.005 60

3 讨论

3.1 梯度洗脱条件的选择［9-11］检测升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷时，发现升麻素苷在乙腈-0.1%磷酸为15∶85时，tR=8.3 min，但5-0-甲基维斯阿米醇苷的tR=28 min，不利于样品分析。故等度洗脱10 min后，改为梯度洗脱，增加乙腈的比例，5-0-甲基维斯阿米醇苷的tR=18.2 min，且前后杂质均与之得到良好分离，方法学试验良好。

3.2 欧前胡素测定波长的选择 在白芷的提取中，将其主要成分欧前胡素作为检测指标，参考文献［12］，采用254、300、310 nm作为检测波长。结果，254 nm有最大吸收，通过不断调节甲醇-水的比例，当比例为68∶32时，方法学验证较好，杂质能与欧前胡素峰完全分离，精密度好，回收率高。

3.3 样品提取方法和时间的选择 选用70%、80%和100%甲醇等超声提取方法，结果在测定升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷时，选用80%甲醇超声提取方便，提取成分对测定无干扰。而在测定欧前胡素时，90%甲醇效果较好。

3.4 超声时间的选择 分别超声处理15、30、45 min，结果30 min即可将有效成分溶解完全。

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Determ ination of prim-O-glucasylcim ifugin，5-O-methylvisamm iosode and imperatorin in Jili Fangbai Sustained Release Dropping Pills by HPLC

ZHOU Li-juan1， SHEN Ming-hui1， LIMin2， YIN Ting-ting2， SUN Xiao-yan1， CAOWei1*

（1.Translational Medicine Center，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 45OOO7，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 45OOO7，China）

Jili Fangbai Sustained Release Dripping Pills；prim-0-glucasylcimifugin；5-0-methylvisammio-

R927.2

A

1001-1528（2015）12-2655-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.018

2015-04-17

常州四药临床药学科研基金 （CZSYJJ13026）

周丽娟 （1979—），女，硕士，副主任药师，从事药物新剂型和新技术研究。Tel：（0371）67690341，E-mail：zhou750423 @126.com

*通信作者：曹 巍（1963—），男，教授，从事肿瘤学研究。Tel：（0371）67690341，E-mail：zxyxzxsysvip@163.com