颜茂华 许斌 赵立来 朱求亮 罗建民 杨正明

1.浙江省安吉县人民医院骨科，浙江安吉313300；2.浙江大学医学院附属第二医院，浙江杭州310009

微小RNA-144上调Rb抑制骨肉瘤细胞增殖及诱导凋亡

颜茂华1许斌1赵立来1朱求亮1罗建民1杨正明2

1.浙江省安吉县人民医院骨科，浙江安吉313300；2.浙江大学医学院附属第二医院，浙江杭州310009

目的探讨微小RNA-144（miR-144）对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及相关蛋白影响。方法运用脂质体转染的方法，在骨肉瘤细胞株MG-63中转染不同浓度miR-144类似物（miR-144组），随机miR-144片段作为阴性对照组。实时定量PCR检测miR-144表达水平。DAPI染色观察miR-144对细胞形态的影响，用MTT检测细胞增殖，Annexin/PI双染确定细胞凋亡比例。免疫印迹检测PTEN以及Rb等抑癌基因编码蛋白和凋亡相关蛋白表达情况。结果实时定量PCR结果显示，miR-144组miR-144的表达（1128.54±738.52）明显高于空白对照组（1.00±0.00）和阴性对照组（2.06±0.73）（P<0.01）。与阴性对照组和空白对照组比较，miR-144组细胞数量明显减少，增殖受抑制，流式细胞检测显示，细胞凋亡率明显增加。免疫印迹检测显示，Rb和PTEN表达水平有所增加，而凋亡相关的Caspase-3活化，线粒体膜上Cyto C释放。而阴性对照组与空白对照组以上数值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论合成的miR-144片段（miR-144 mimic）能顺利进入细胞并上调miR-144的表达，对骨肉瘤细胞都有一定程度的抑制作用，并有浓度依赖性，对MG-63的抑制效果最强，并通过活化Caspase-3促进凋亡，上调PTEN和Rb的表达实现对细胞的抑制作用。未来可以基于miR-144进行骨肉瘤治疗的短核苷酸类药物开发。

骨肉瘤；微小RNA-144；增殖；凋亡

骨肉瘤是好发于青少年的恶性肿瘤，手术方法多为广泛切除或截肢，致残致畸，患者后续生活质量较差，故而早期预警、诊断以及治疗变得异常重要。近年

来研究发现，微小RNA（miRNA）在多重疾病的发生发展中扮演重要作用，miRNA作为一种非编码单链小分子RNA，由21～25个核苷酸组成，通过与目标mRNA3端非编码区域序列非完全互补结合，导致mRNA翻译的抑制，进而降解，由60～110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。miRNA可与靶mRNA分子的3’非编码区（3’．UTR）不完全互补序列结合，通过抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，在转录后水平达到基因沉默效果。研究发现，多种miRNA在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤中扮演癌基因或者抑癌基因的角色，特定的miRNA参与肿瘤发生、发展的各个阶段[1，2]。

近年来，国内外的一些研究显示骨肉瘤患者正常组织和肿瘤组织中的miRNA表达谱不同，魏任雄等[3]研究显示，其中的miR-144表达在骨肉瘤表达中低于正常骨组织39倍。miR-144同时也在结肠癌中表达下调，并与结直肠癌的进展息息相关，可以作为结肠癌的分子诊断标志物[4，5]。在一些研究中显示，miR-144下调后，可通过EZH2和Wnt信号通路引起膀胱癌细胞增殖[6]。其他针对miR-144的功能研究发现，GATA4可以激活miR-144前体并诱导表达，而且有研究显示，当miR-144表达后可引起心肌细胞凋亡，抑制增殖，并被认为是治疗缺血性心脏病的潜在靶点[7]。而目前关于miR-144对骨肉瘤细胞生物学功能的影响尚未见有报道，因此，本研究着重探索miR-144对骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、细胞周期以及凋亡的影响。探讨miR-144在骨肉瘤发生发展中的作用和功能。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人骨肉瘤细胞株MG-63、U-2 OS、Saos-2细胞购自上海生命科学研究院细胞资源中心，购买后大扩并保存一批MTT、DMSO，凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司，DAPI购自Sigma公司，miRNA144类似物购自上海吉玛制药技术有限公司，序列为FAM-5’-UACAGUAUAGAUGAUGAUGUACU-3’。阴性对照（Control，缩写为“Con”）miRNA为随机合成，序列为FAM-5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’，DEPC水溶解后制备成10 μM储液用于细胞转染。空白对照组为不含RNA的转染试剂组。与大鼠基因组各基因均无显著同源性。临用时根据要求使用完全培养液稀释为目标浓度。RPMI-1640培养液为Gibco公司产品，小牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司，转染试剂Lipofectmine 2000脂质体购自Life Technology公司。其余试剂均为分析纯或者分子试剂级别。

1.2 细胞培养

将冻存的骨肉瘤细胞株从液氮罐取出，细胞常规复苏及传代。取对数生长期细胞，以0．25%的胰蛋白酶消化后用PBS（pH7．2）洗涤3次，用含体积分数为10%的小牛血清RPMI 1640培养液将细胞终浓度调至8×104细胞/mL，接种到96孔或6孔板中。细胞转染时，空白对照组：加等量的完全RPMI-1640培养液和转染试剂；miRNA144组：用完全RPMI-1640培养液稀释后加入到细胞中，使得终浓度20nM、40nM和80nM；阴性对照组：转染试剂加随机RNA序列组。转染后，置5%CO237℃培养箱中培养6 h后，换新鲜培养液，后续收集细胞进行相关实验。

1.3 细胞凋亡形态观察

细胞爬片后，用不同浓度miR-144处理48 h后，冷甲醇固定细胞，使用DAPI染色5 min，磷酸缓冲液PBS洗1次，将有细胞的一面倒扣于事先滴加有荧光防淬灭剂载玻片上，用倒置荧光显微镜观察。

1.4 凋亡细胞比例检测

收集48 h经过不同浓度miR-144处理的骨肉瘤细胞，根据膜联蛋白V（Annexin V）/PI细胞凋亡检测试剂盒说明处理，细胞以PBS洗2次，再用1×结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×108/mL，分别取100 μL细胞液至5 mL离心管，加入异硫氰酸荧光素标记的5 μL膜联蛋白V和5 μL碘化吡啶，轻轻搅拌混匀，置于暗处室温孵育15 min后，过300目孔径尼龙膜后转移至流式细胞样本管中，然后用流式细胞仪C6（BD公司）进行分析检测。设置空白对照和单染组细胞用于流失细胞设“门”，每次分析20 000个细胞，实验重复3次，取均值。

1.5 免疫印迹

使用冷的PBS淋洗2遍，在RIPA裂解液中冰上裂解细胞，收集细胞蛋白后在10%的SDS-PAGE胶上电泳。蛋白分离后经恒流1．5 h电转移到PVDF膜后，使用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭1 h，与凋亡相关以及周期相关的特异性抗体室温孵育1 h或者4℃过夜后，次日加入含二抗室温作用1 h后，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL发光液，暗室中压片显影。

1.6 统计学方法

正态分布的实验数据以（x±s）表示，计量资料采用t检验，利用SPSS12．0统计学软件进行分析，凋亡miRNA不同处理组用单因素方差分析。

2 结果

2.1 miR-144对骨肉瘤细胞增殖的影响

miR-144转染骨肉瘤细胞48 h后，可引起3种骨肉瘤细胞株生长的抑制，在浓度为40 nM和80 nM时，对MG-63的抑制最强，达到（50±6）%抑制率，且抑制效果有浓度依赖性，随着miR-144类似物（mimic）浓度增加抑制率增加，Con为阴性的类似物，也有一定的抑制率，说明脂质体转染对细胞本身有一定的毒性，见封三图4A。3种骨肉瘤细胞中，MG-63对miR-144最为敏感。此外我们对miR-144转染后表达情况荧光显微镜检测FAM红色荧光强度，见封三图4B，随着miR-144终浓度的增加，荧光的分布和强度增加，对照组中（Con）荧光强度类似20 nM miR-144的作用强度。

2.2 miR-144对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响

设置对照组，miR-144 0～80 nM组作用MG-63骨肉瘤细胞，48 h后，用冷乙醇固定细胞，使用DAPI甲醇溶液对细胞染色（图1），随着miR-144浓度的增加，细胞数量逐渐减少，说明对MG-63细胞增殖有较为显著的抑制作用。

图1 miR-144不同浓度作用MG-63细胞48 h后DAPI染色结果，Con为阴性对照，所有照片在200倍荧光显微镜下获得

miR-144处理48 h后，胰酶消化收集骨肉瘤细胞，利用AnnexinV/PI双染检测凋亡，如表1所示，miR-144处理的3个不同浓度组中，正常细胞比例均有一定程度的下降，与阴性对照组和空白对照组比，差异均有统计学意义（P＜0．05）；早期凋亡细胞比例在miR-144不同浓度组中均有显著上升（P＜0．05），并以40 nM组中比例最高，与阴性对照组和空白对照组比，差异均有统计学意义（P＜0．05）；miR-144处理后，晚期凋亡比例亦上升，与阴性对照组和空白对照组比，差异有统计学意义（P＜0．05）；此外，miR-144处理后，还引起一定比例坏死细胞的产生，其中以80 nM处理组比例最高，与阴性对照组和空白对照组比，差异有统计学意义（P＜0．05）。以上结果证明miR-144进入骨肉瘤细胞48 h后可引起细胞凋亡和坏死，且效应呈浓度依赖性。单因素方差分析表明，miR-144不同浓度组对骨肉瘤细胞凋亡不同分期比例有显著影响，见表1。

2.3 miR-144对凋亡相关信号通路的影响

为了解miR-144诱导MG-63骨肉瘤凋亡的具体机制，收集miR-144处理后细胞并获取蛋白，用免疫印迹检测凋亡标志性分子信号Caspase-3和内源性凋亡标志物——细胞色素C（Cyto C）。与2．1结果趋势相类似的是，随着miR-144作用浓度的增加，Cyto C的表达逐渐增加，说明原先定位在线粒体中的蛋白因线粒体膜通透性改变而释放出来。而Caspase-3活化形式表达逐渐增加，而其前体水平表达下调（图2A），提示发生典型凋亡。结果显示miR-144作用下，可能引起细胞内源性凋亡途径激活。有研究显示，miR-144作用后还可引起Rb及PTEN的表达变化，因此我们进一步对PTEN表达及Rb的活化情况进行检测（图2B），结果显示PTEN在80 nM时有比较显著的上调，而Rb的磷酸化在20 nM时就出现明显的变化，提示Rb的上调在miR-144所诱导的增殖和凋亡中起着重要作用。以上结果说明，miR-144可诱导细胞凋亡发生，其作用具有浓度依赖性，主要形式可能为内源性途径。

图2 miR-144免疫印迹检测凋亡蛋白表达，miR-144作用MG-63细胞48 h后，免疫印迹检测凋亡相关的以及抑癌基因PTEN和Rb及其磷酸化状态（p-Rb）的情况

表1miR-144作用后对骨肉瘤细胞凋亡不同期比例的影响（x±s，%，n=3）

3 讨论

研究发现，miRNA主要在基因转录后水平发挥作用，与靶mRNA可以发生特异性非完全互补结合，引起基因表达下调。在不同物种间，miRNA序列具有高度的保守性、组织特异性和时序性。文献报道显示，miRNA的异常表达与特定肿瘤的发生具有一定的相关性，对miR-144的研究显示，其下游细胞增殖有关靶基因主要包括LGR4、MAP3K4等，除此之外miR-144以Caspase-3为直接靶目标而发挥抗凋亡的作用。而Caspase-3的活化也是凋亡的经典途径之一。本研究中的结果发现，提示miR-144可直接诱导Caspase-3活化，通过内源性途径启动凋亡发生。

miRNA可以在肿瘤发生、进展及转移过程中起到重要作用，miR-144在多种疾病中均发生了显著变化，但是主要研究集中在血液系统，对于肿瘤方面的研究较少。Wang等[8]通过荟萃分析发现，骨肉瘤组织中存在差异表达的miRs，其中包括miR-144在结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、喉癌、恶性间皮瘤的组织中均存在异常表达，miR-144在喉癌[9]、宫颈癌[10]、甲状腺滤泡癌[11]以及恶性间皮瘤[12]中下调。体外构建miRNA-144表达载体以后并转染细胞，可引起细胞生长阻滞，并出现死亡，主要原因是引起凋亡，我们的研究结果与在肝癌及非小细胞肺癌中[13]的研究结果相一致，普遍认为miR-144可作为一个肿瘤增殖的抑制基因存在并影响骨肉瘤患者预后。有研究显示miR-144主要通过调节PTEN及Rb1等抑癌基因的翻译发挥抑癌作用，本研究结果也证实了这一点，同时可能Rb的活化程度要强于PTEN的表达。

miR-144不仅影响细胞增殖，而且诱导细胞凋亡，有研究报道，过表达miR-144的质粒转染肝癌HepG2细胞后促进细胞凋亡[14]，通过影响E2F3表达还可以抑制肝癌转移的发生[15]。根据凋亡启动分子的差异，可将凋亡类型分为内源性途径和外源性途径，前者又称为线粒体途径，主要表现为线粒体内特异性蛋白如细胞色素C（Cyto C）因为膜通透性的变化而释放到细胞浆内，再有如Bax表达以及线粒体膜电位变化等。而外源性途径后者则主要以Fas/FasL为代表，体现为下游Caspase-8的活化。进一步对Caspase-3的检测不仅验证前面的DAPI染色的现象，而且在分子水平证明存在比较明确的凋亡现象。在Caspase家族中，Caspase-3是Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡蛋白酶。通过上调Caspase-3活化形式的表达，诱导细胞凋亡。研究发现，miR-144不仅能激活反映DNA损伤程度的PARP，而且上调Caspase-3活化形式表达，最终引起细胞凋亡。本研究显示miR-144诱导的凋亡主要可能为线粒体途径，表现miR-144作用后细胞色素C的大量释放进入胞浆。针对Rb和PTEN的检测也提示有一定程度的活化，但是程度不如细胞色素C明显，提示细胞中的信号通路往往不是非此即彼的关系，可能还存在较多的Crosstalk。此外在最近的一项研究中表明miR-144通过影响ADAMTS5和ADAM10抑制头颈部肿瘤转移[3]。骨肉瘤患者在确诊前有80～90%发生全身的微病灶转移[16]，因此，在未来研究中我们还可以探讨miR-144对骨肉瘤细胞转移能力的影响。

[1]程冬冬，杨庆诚．MicroRNA与骨肉瘤研究进展[J]．医学综述，2013，19（11）：1967-1970．

[2]胡波，吴苏稼．微小RNA在骨肉瘤中的研究进展[J]．医学研究生学报，2013，26（5）：524-527．

[3]魏任雄，蔡林，谭金海，等．骨肉瘤miRNA基因的差异性表达[J]．中华实验外科杂志，2009，26（5）：636-638．

[4]M Kalimutho GB，S Di Cecilia PS．Differential expression of miR-144*as a novel fecal-based diagnostic marker for colorectal cancer[J]．J Gastroenterol，2011，46（12）：1391-1402．

[5]Iwaya T，Yokobori T，Nishida N，et al．Downregulation of miR-144 is associated with colorectal cancer progression via activation of mTOR signaling pathway[J]．Carcinogenesis，2012，33（12）：2391-2397．

[6]Y Guo LY，Y Tian PY，Y Zhu ZW．miR-144 downregulation increases bladder cancer cell proliferation by targeting EZH2 and regulating Wnt signaling[J]．FEBSJ，2013，280（18）：4531-4538．

[7]Zhang X，Wang X，Zhu H，et al．Synergistic effects of the GATA-4-mediated miR-144/451 cluster in protection against simulated ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte death[J]．J Mol Cell Cardiol，2010，49（5）：841-850．

[8]Wang W，Peng B，Wang D，et al．Human tumor microRNA signatures derived from large-scale oligonucleotide microarray datasets[J]．Int J Cancer，2011，129（7）：1624-1634．

[9]Wang P，Fu T，Wang X，et al．[Primary，study of miRNA expression patterns in laryngeal carcinoma by microarray[J]．Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2010，24（12）：535-538．[10]Tian Y，Tian Y，Luo X，et al.Identification and characterization of microRNAs related to salt stress in broccoli，using high-throughput sequencing and bioinformatics analysis[J].BMC Plant Biol，2014，14（1）：226.

[11]Rossing M，Borup R，Henao R，et al.Down-regulation of microRNAs controlling tumourigenic factors in follicular thyroid carcinoma[J].J Mol Endocrinol，2012，48（1）：11-23.

[12]Guled M，Lahti L，Lindholm PM，et al.CDKN2A，NF2，and JUN are dysregulated among other genes by miRNAs in malignant mesothelioma：A miRNA microarray analysis[J].Genes Chromosomes Cancer，2009，48（7）：615-623.建和脑灌注成像在急性颅脑损伤动态变化中应用[J].中华神经外科杂志，2012，28（11）：1163-1166.

[8]Banu KY，Niyazi OD，Erdem C，et al.Value of heart-type fatty acid-binding protein（H-FABP)for emergency department patients with suspected acute coronary syndrome[J]. Afr Health Sci，2014，14（3）：757-762.

[9]贾进明，濮翔科，陈建.急性颅脑损伤后肺损伤患者血清Th1/Th2细胞因子表达分析[J].中华医院感染学杂志，2012，22（17）：3700-3701.

[10]Oezkur M，Gorski A，Peltz J，et al.Preoperative serum h-FABP concentration is associated with postoperative incidence of acute kidney injury in patients undergoing cardiac surgery[J].BMC Cardiovasc Disord，2014，（14）：117.

[11]孙玉发，衣志勇，蒋知新，等.心型脂肪酸结合蛋白在急性冠状动脉综合征患者危险分层中的价值[J].中华老年心脑血管病杂志，2011，13（2）：115-118.

[12]何永利，黄廷富，潘小平.急性脑梗死患者H-FABP检测结果的临床分析[J].中华临床医师杂志（电子版），2013，（21）：9506-9509.

[13]陈小亮，刘向儒.丹红对非ST段抬高心肌梗死血清MCP-1及H-FABP的影响[J].中华全科医学，2013，11（9）：1378-1379.

[14]王冬梅，常杰，白云贤，等.急性颅脑损伤血清性激素水平变化与预后的研究[J].中华神经外科杂志，2014，30（7）：715-717.

[13]Zha W，Cao L，Shen Y，et al.Roles of Mir-144-ZFX pathway in growth regulation of non-small-cell lung cancer[J].PLoS One，2013，8（9）：e74175.

[14]王铮，张明鑫，张灵敏，等.miR-144表达质粒的构建及其对肝癌细胞生物学行为的影响[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2011，39（10）：17-22.

[15]Cao T，Li H，Hu Y，et al.miR-144 suppresses the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting E2F3[J].Tumor Biology，2014，35（11）：10759-10764.

[16]叶友友，张俐.骨肉瘤转移机制的研究概况[J].中国中医骨伤科杂志，2012，20（11）：68-70.

（收稿日期：2014-10-23）

miR-144 supresses proliferation and induces apoptosis of osteosarcoma cells by upregulating Rb

YAN Maohua1XU Bin1ZHAO Lilai1ZHU Qiuliang1LUO Jianmin1YANG Zhengming2
1.Department of Orthopaedics，the People's Hospital of Anji County in Zhejiang Province，Anji313300，China；2.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou310009，China

Objective To study the influences of microRNA-144 on osteosarcoma cells from proliferation，apoptosis and the expression of related protein.Methods Different concentration of miR-144 was transfected into osteosarcoma MG-63 cell lines by the method of lipofectmine.The cell lines were divided into 3 groups：normal group，miR-144 transfected group，and negative group which was transfected with random miR-144 fragment.The proliferation of cells was detected by the MTT assay.The expression of miR-144 was detected by Real-Time PCR.DAPI staining was carried to study the influence of miR-144 on the morphology of MG-63.And the percentage of apoptosis was observed by flow cytometry with the Annexin/PI staining.Expression of tumor suppressor such as PTEN and Rb and the protein related with apoptosis were evaluated by western blotting.Results RT-PCR indicated a higher expression of miR-144 in transfected group（1128.54±738.52）compared with the normal group（1.00±0.00）and negative group（2.06±0.73）（P＜0.01）.The proliferation of miR-144 transfected cells was significantly lower than that in normal group and negative group.Further，a higher apoptosis rate was detected by flow cytometry with a statistically significant upregulation of PTEN，Rb，Caspase-3 and Cyto C in transfected group，indicating an internal apoptosis pathway was involved in this process.Moreover，no significant changes were found in the normal group and negative group（P>0.05）.Conclusion miR-144 could transfectd into cells by the method of liposomal transfection and in turn upregulate the expression of miR-144 mimic，with an inhibition on the proliferation of MG-63.The underlying mechanisms may relate to the upregulation of tumor suppressor and activation of protein associated with caspase-3 signaling pathway，with providing a novel horizon in short nucleotide drugs on the management of osteosarcoma.

Osteosarcoma;Micro RNA-144;Proliferation;Apoptosis

R738.1

A

1673-9701（2015）06-0006-04

2014-12-15）

浙江省医药卫生科技计划项目（2010KYB052）