袁浩锋??何科??汪中扬??瞿虎??张靖??马波

[摘要] 目的 通过体外研究观察不同浓度盐霉素及其联合应用紫衫醇、丝裂霉素对膀胱移行细胞癌T24细胞增殖活性的抑制作用。 方法 将盐霉素（SAL）单药分别配成盐霉素0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mg/mL培养液并分不同浓度处理组；盐霉素（SAL）联合紫杉醇（PAC）联合用药处理：使用细胞培养液配成五种不同浓度，以PAC 0.5μg/mL为阳性对照组；盐霉素（SAL）联合丝裂霉素（MMC）联合用药处理五种浓度，并以MMC 2.0μg/mL为阳性对照组；各组均设空白及阴性对照。分别于药物处理24h（或48h）及48h（或72h）后通过CCK8法测定吸光度，并计算细胞生长抑制率及相对细胞生长抑制率。 结果 不同浓度盐霉素单独用药后对细胞的生长出现增殖活性均有抑制作用；不同浓度盐霉素联合紫杉醇对增殖活性明显的抑制作用，且具有一定的时间依赖性。盐霉素联合丝裂霉素对膀胱移行细胞癌T24细胞的体外增殖活性有显著抑制作用。 结论 不同浓度盐霉素单用及联合应用紫杉醇或丝裂霉素均对T24细胞增殖活性有抑制作用，并且与浓度和时间一定的依赖性。

[关键词] 盐霉素；膀胱癌；T24细胞；紫杉醇；丝裂霉素

[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）17-27-05

In vitro inhibition effect of single medication and combined medication of salinomycin on bladder transitional cell carcinoma T24 cell proliferation

YUAN Haofeng1 HE Ke2 WANG Zhongyang3 QU Hu3 ZHANG Jing3 MA Bo3

1.Department of Urinary Surgery， Dongguan Third People's Hospital， Dongguan 523326， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， First Affiliated Hospital of Zhongshan University， Guangzhou 510080， China； 3.Department of Urinary Surgery， Sixth Affiliated Hospital of Zhongshan University， Guangzhou 510080， China

[Abstract] Objective To observe inhibition effect of various concentration of salinomycin combined with paclitaxel or with mitomycin on bladder transitional cell carcinoma T24 cell proliferative activity in vitro study. Methods Culture medium with 0.1mg/mL， 0.2mg/mL， 0.4mg/mL， 0.8mg/mL and 1.6mg/mL of salinomycin were respectively prepared and they were allocated to different concentration treatment group. Combined medication of SAL with paclitaxel （PAC） included that cell culture medium was prepared into five different concentration and positive PAC 0.5μg/mL was set as the control group. Combined medication of SAL with mitomycin （MMC） was prepared into five different concentration and positive MMC 2.0μg/mL set as the control group. Each group had bank control and positive control. Absorbance of 24 hours （or 48 hours） and 48 hours （or 72 hours） after medicament treatment was detected by CCK8 method. In addition， cell growth inhibition rate and relative cell growth inhibition rate were calculated. Results Different concentration of SAL had different inhibition effects on cell proliferative activity. Different concentration of SAL combined with PAC had obvious inhibition effect on cell proliferative activity and it had time-dependent manner. SAL combined with MMC had significant in vitro inhibition effect on bladder transitional cell carcinoma T24 cell proliferative activity. Conclusion Single mediation of SAL or different concentration of SAL combined with PAC or MMC all had inhibition effect on T24 cell proliferative activity and it is dependent on concentration and time to some degree.

[Key words] SAL； Bladder cancer； T24 cell； PAC； MMC

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一，

在60岁以后其发病率甚至超过肾肿瘤居国内泌尿系恶性肿瘤发病第1位，占恶性肿瘤发病构成的2.5%，且总体发病率仍呈不断增长趋势[1]，具有高复发率和进展率的特点，发达国家中膀胱癌已成为最沉重的医疗负担[2]，如何寻找行之有效的治疗手段已成为临床急需解决的实际问题。Gupta等（2009）[3]发现盐霉素能抑制乳腺癌干细胞形成肿瘤微球体，并抑制乳腺癌胞生长、浸润和转移能力并逆转肿瘤细胞的多重耐药性的能力。此后大量研究表明盐霉素对白血病、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤细胞均有抗杀伤作用[4-6]，但此种作用在盐霉素对人膀胱移行细胞癌T24细胞方面的研究匮乏。本实验即通过体外研究观察不同浓度的盐霉素及其联合紫衫醇、丝裂霉素对膀胱移行细胞癌T24细胞增殖活性的抑制作用，探索临床实际对于膀胱癌治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

盐霉素标准品购自上海伊卡生物技术有限公司，紫衫醇购自上海金穗生物科技有限公司，丝裂霉素（浙江海正药业股份公司，H33020786），RPMI1640培养基、胎牛血清、双抗、胰酶购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自广州义邦生物有限公司。人膀胱癌T24细胞来自武汉大学中国典型培养物保藏中心，由中山大学附属第二医院保存及提供，传至第3代。

1.2 细胞培养及传代

细胞培养液的配置以10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100U/mL链霉素的RPMI 1640培养基混合而成；T24细胞置于条件37℃恒温培养箱2～3d传代一次。

1.3 药物配置及分组

盐霉素（SAL）单药处理：在细胞培养液中加入盐霉素，配成盐霉素0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mg/mL培养液并分不同浓度处理组；盐霉素（SAL）联合紫杉醇（PAC）联合用药处理：使用细胞培养液配成PAC 0.5、PAC 0.5+SAL 10、PAC 0.5+SAL 40、PAC 0.5+SAL 160、PAC 0.5+SAL 640μg/mL五种浓度（其中每组中PAC浓度为0.5μg/mL）， PAC 0.5μg/mL为阳性对照组，；盐霉素（SAL）联合丝裂霉素（MMC）联合用药处理：使用细胞培养液配成MMC 2.0、MMC 2.0+SAL 10、MMC 2.0 +SAL 40、MMC 2.0+SAL 160、MMC 2.0+SAL 640μg/mL五种浓度（其中每组中MMC浓度为2.0μg/mL），以MMC 2.0μg/mL为阳性对照组；各组均设空白及阴性对照。

1.4 细胞药物处理及检测

取对数生长期细胞以每孔100μL（约5×103细胞）接种于96孔板，置于培养箱中培养24h。观察细胞贴壁生长后，弃去原培养基，加入不同浓度药物进行干预，并设以纯培养液处理的阴性对照组及不含细胞纯培养液的空白组，每组设5个复孔。分别于药物处理24h（或48h）及48h（或72h）后通过CCK8法测定吸光度，并使用以下公式计算细胞生长抑制率及相对细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=[1-（处理组吸光度-空白组吸光度）/（阴性对照组吸光度-空白组吸光度）]×100%；相对细胞生长抑制率（%）=[1-（处理组吸光度-空白组吸光度）/（阳性对照组吸光度-空白组吸光度）]×100%。

1.5 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料采用t检验，使用（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外研究盐霉素单药对膀胱移行细胞癌T24细胞增殖活性的抑制

对照组T24细胞增殖活跃，不同浓度盐霉素单独用药后对细胞的生长出现增殖活性不同程度抑制作用，有浓度及时间依赖性。如表1所示，使用盐霉素处理T24细胞于24h即显示出增殖抑制，并且随着药物浓度增殖抑制作用更显著，相同浓度下48h时间比24h更为明显。除SAL 0.1mg/mL组外，其余各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 盐霉素联合紫杉醇对膀胱移行细胞癌T24细胞增殖活性的抑制

体外研究不同浓度盐霉素联合紫杉醇作用于膀胱移行细胞癌T24细胞均显示对增殖活性明显的抑制作用（P<0.05）。见表2。以PAC 0.5μg/mL为阳性对照组计算得相对抑制浓度，联合用药组比PAC 0.5μg/mL阳性对照组出现明显浓度依赖性抑制作用，且除SAL10+PAC 0.5μg/mL组外，其余各组间比较差异均具有统计学差异（P<0.05）。见表3。紫衫醇联合不同浓度盐霉素的抑制作用具有明显的盐霉素浓度依赖性并一定的时间依赖性。

2.3 盐霉素联合丝裂霉素对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用

不同浓度的盐霉素联合丝裂霉素对膀胱移行细胞癌T24细胞的体外增殖活性有显著时间依赖性及一定程度的浓度依赖的抑制作用以MMC2.0μg/mL为阳性对照组，联合用药组比MMC 2.0μg/mL阳性对照组出现明显浓度及时间依赖性抑制作用，并且除MMC2.0+SAL 10μg/mL组外，其余各组间比较差异均具有统计学差异（P<0.05）。见表4～5。

3 讨论

盐霉素早期主要是作为家禽的抗球虫药和反刍动物的生长促进剂来使用，其属一元羧酸聚醚类离子载体动物用抗生素，具抗菌、抗真菌、抗寄生虫、抗疟药、抗病毒等广泛的生物活性[7]。2009年Gupta等[3]在高通量筛选研究中发现其具有抑制乳腺癌胞生长、浸润和转移能力并逆转肿瘤细胞的多重耐药性的能力。随后研究表明盐霉素对白血病、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤细胞均有抗杀伤作用[4-6]。