石鑫 张皓 孙颖 朱文宇 王书全

(辽宁省医学院畜牧兽医学院 121001)

猪水疱病RT-nPCR方法的建立及初步应用

石鑫 张皓 孙颖 朱文宇 王书全*

(辽宁省医学院畜牧兽医学院 121001)

为了建立猪水疱病RT-PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的猪水疱病16SrRNA基因序列，设计内、外2对特异性引物，进行RT-PCR检测方法研究。结果表明，能够扩增的基因片段大小为687bp，与GenBank收录的相关序列同源性高达93.2%，对62份样品进行了检测，阳性率为22.58%。

猪水疱病;RT-PCR;建立;应用

猪水疱病 （Swinevesiculardisease，SVD）病原是猪水疱病病毒（SVDV）为小RNA病毒科肠道病毒属的成员。猪水疱病是猪的一种急性传染病，其临床表现以口鼻腔粘膜、蹄部出现水疱或溃烂为特征。目前，常用的SVDV实验室诊断方法无法快速准确的对该病进行确诊，以致错过最佳的预防治疗时机，造成严重的经济损失。本研究通过建立SVDV反转录-巢式PCR（RT-nPCR）方法，开展对SVD的快速诊断研究，为猪水疱病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品与对照病毒株

采自辽宁省锦州地区养猪户或养猪场水疱性疾病的水疱液或水疱皮62份；对照毒株为口蹄疫病毒、水疱性口炎均由辽宁医学院预防兽医实验室保存，猪水疱性疹病毒基因片段质粒由辽宁医学院实验动物中心惠赠。

1.2 主要试剂与仪器

全血基因组RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，质粒小量制备试剂盒、DH5α 感受态菌和 pMDl8-TVector、TakaraExTaq聚合酶等均购于大连宝生物公司、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR扩增仪（BIO-RAD公司）；PCA300型电泳仪（Bio-RAD公司）。

1.3 引物的设计合成

根据GenBank上发表的猪SVDV VP1基因序列，利用分子生物学软件对序列比对分析后，利用Primer5.0设计出下列引物，设计内、外2对特异性引物，能够扩增出681bp基因片段：

外引物：P1-GACTCCGATGGCGACAACTT；P2-TTGCTTGTCAAACCT GGC。

内引物：P3-ACTTGGGAGCGGAC CAGTTA；P4-GAGCAACTTGCCGTGTGT。

1.4 样本基因RNA的提取及反转录

按照提取试剂盒说明书进行操作。

1.5 反应条件的建立与优化

通过试验，建立并优化RT-nPCR反应条件和反应体系，最佳反应条件和反应体系为：

总 体 系 为 25μl： 模 板 1μl，2.5mmol/LdNTP2μl， 50pmol/L 的 P1和 P2各 0.2μl， 100pmol/L的 P3和 P4各 3μl， 10xPCRbuffer2.5μl， ExTaq 聚合酶 1μl， ddH2O13.6μl。

反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性 45s； 58℃退火 45s， 72℃延伸45s， 5个循环； 94℃， 5min； 94℃变性20s； 54℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 30个循环；72℃，5min。

1.6 最佳退火温度的确定

外引物最佳退火温度确定：在其他反应条件不变，对第一轮PCR的退火温度进行温度梯度PCR，退火温度范围为56～70℃；外引物最佳退火温度确定：在确定外引物最佳退火温度后，使用内引物进行温度梯度PCR，退火温度范围为51～55℃，其他反应条件不变。内外引物的最佳退火温度均根据目的条带的亮度确定。

1.7 PCR产物的克隆和测序

在PCR之后，在1%琼脂糖凝胶中电泳进行检测，将目的条带使用胶回收试剂盒回收，与pMD18-T载体于4℃连接过夜后，然后转化进感受态大肠埃希菌DH5α，挑取具有氨苄抗性的阳性克隆，提取质粒，进行测序。

1.8 特异性试验

分别提取口蹄疫病毒、猪水疱性口炎、猪水疱性疹的反转录DNA作为模版，稀释至标准浓度，按l.5所述的反应体系和条件进行RT-PCR扩增。

1.9 敏感性检测

提取阳性猪水疱病病毒反转录DNA，测定其OD值，计算出DNA浓度，然后进行10倍倍比稀释后，进行RT-PCR扩增。

1.10RT-nPCR的临床应用

应用建立的检测方法对来自锦州地区62份样本进行检测。

2 结果

2.1 PT-PCR扩增结果及目的基因的测序

测序结果表明，获得基因片段的大小为681bp。同Genbank中所列相关基因进行比较，基因同源性在93.2%。图1为可样品检测结果。

图1 PCR扩增结果

2.2 最佳退火温度的选择

图2表明，使用外引物P1、P2时，退火温度在59℃目的条带最亮，因此确定最佳外引物退火温度为59℃；图3表明，退火温度在52℃时条带最亮，所以确定最佳内引物退火温度为52℃。

图2 外引物温度梯度PCR结果

2.3 特异性检测

结果显示，以SVDV阳性全血作为模板进行RT-nPCR反应可以扩增得到大小为687bp的特异性条带，而以口蹄疫病毒、猪水疱性口炎、猪水疱性疹的反转录DNA作为模版则均未见特异性条带。

2.4 敏感性检测

图3 内引物温度梯度PCR结果

结果显示，当样本反转录基因组DNA稀释到105倍时RT-PCR还能见到清晰的条带，说明该猪水疱病RTPCR方法有较高的敏感性。

2.5 临床样本检测

应用所建立的检测方法对来自锦州地区62份样本进行检测，结果检测出阳性样本14例，阳性率22.58%。

2013年辽宁省大学生创新创业训练计划项目：猪水疱病RT-nPCR方法的建立及初步应用（201310160025）。

石鑫（1991-），女，辽宁省海城市人，本科学生，动物医学专业。