陈伟 ，周鹏宇，朱永杰，马胜利，曹叶,4，张萍萍,5，何湘，魏从文，钟辉，吴飞翔

1.广西医科大学附属肿瘤医院 肝胆外科，广西 南宁 530021；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；3.安徽大学 健康科学院，安徽 合肥 230039；4.吉林大学 分子酶学工程实验室，吉林 长春 130012；5.济南军区总医院 实验检验科，山东 济南 250031

乳腺癌是现代女性最常见的肿瘤之一，它的发生发展和许多因素相关，其中与雌激素受体（estrogen receptor，ER）的关系最为密切[1-2]。ER属于类固醇核受体，包括ERα和ERβ两个亚型，ERα促进乳腺癌的发生发展，而ERβ抑制乳腺癌的发生[3-4]。目前关于ERα的研究相对较多。ERα含595个氨基酸残基，相对分子质量约为66×103，包含5 个结构域，依次为不依赖配体激活的AF1、负责与靶基因启动子的雌激素反应元件（estrogen receptor elements，ERE）特异结合的DNA 结合域（DNA binding domain，DBD）、核定位信号的铰链区、配体结合功能区（ligand-binding domain，LBD）和配体依赖转录的AF2，以及功能不详的可变区[5-7]。ERα常发生翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、SUMO、棕榈化，其中以磷酸化最为常见。现已报道的ERα磷酸化位点有十几个，其中研究比较透彻的有7个，为S104、S106、S118、S167、S236、S305 及Y537[8-9]。不同区域磷酸化对ERα的作用也不同，如DBD区的S236 位点在蛋白激酶A 作用下发生磷酸化，从而抑制ERα二聚化形成，阻断其与DNA 的结合；而由Src酪氨酸激酶介导的Y537 磷酸化主要调节ERα与E2的结合能力[10-11]。这些翻译后修饰常常调节ERα与ERE的结合，从而激活或抑制下游基因的转录，包括c-myc、BCL-2、Bcl-XL、Cyclin D1、IL-8，这些下游基因与乳腺癌的发生、发展有着密切的关系[12-13]。因此，ERα翻译后修饰常为乳腺癌研究的重点和热点。

本课题组前期在乳腺癌相关研究中，通过质谱分析发现在ERα DBD 区224 位苏氨酸（T224）和可变区559 位丝氨酸（S559）发生磷酸化。虽然559 位丝氨酸发生磷酸化已有报道，但对其研究尚少[9]，而224 位苏氨酸磷酸化尚无报道。为此，我们构建了ERα 224 位苏氨酸、559 位丝氨酸磷酸化突变点载体，通过萤光素酶报告基因方法检测这些突变位点对ERα活性是否产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293T 细胞、感受态大肠杆菌DH5α、pRL 质粒、ERE 启动子的萤光素酶报告基因质粒（EREluc）及pcDNA3-Flag 均为本实验室保存；真核表达质粒pcDNA3-Flag-ERα为本实验室构建保存；引物合成及测序由奥科鼎盛生物技术公司完成；限制性内切酶、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司；高保真PfuDNA聚合酶、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Tiangen 公司；萤光素酶活性测定试剂盒购自Promega公司；DMEM培养基购自Gibco生物公司；胎牛血清购自杭州江滨公司；转染试剂LipofectAMINE 2000 购自Invitrogen 公司；鼠抗Flag 抗体购自Santa Cruz公司；雌激素、HRP标记的鼠抗微管蛋白抗体购自Sigma 公司；HRP 标记的羊抗鼠购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 扩增突变片段

利用重组PCR扩增ERα（T224A）、ERα（S559A）突变片段，即ACC突变为GCC、TCC突变为GCC。根据ERα基因序列及点突变需要设计引物（表1），由奥科鼎盛生物技术有限公司合成。

以本实验室构建保存的野生型ERα质粒为模板，用相应的引物，通过PCR 扩增出含有点突变的上、下游目的基因片段（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，进行30 个循环；68℃延伸7 min），经琼脂糖凝胶电泳及上、下游片段回收，以等摩尔比例的上、下游配对片段为共同模板，利用搭桥法进行二次PCR（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸120 s，进行30 个循环；68℃延伸7 min），扩增出点突变的全长目的基因片段。

1.3 构建磷酸化位点突变载体

把全长点突变片段、pcDNA3-Flag 质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ于37℃双酶切过夜，利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段和质粒，再以6∶1（片段∶质粒）的比例混合，室温连接10 min后把连接产物直接转化大肠杆菌DH5α，在氨苄西林培养板上于37℃培养过夜，筛选阳性克隆，以阳性克隆为模板再次行PCR，确定重组质粒上含有目的基因片段后，送奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1.4 细胞培养及转染

用含10%胎牛血清、200 U/mL 青霉素、200 U/mL链霉素的DMEM培养基，在5% CO2、37℃的培养箱中培养HEK293T细胞，当细胞长至10 mm培养皿的60%～80%时用于转染，转染前1 h 更换4 mL 新鲜培养基。先把4 μg 构建的质粒、4 μL 转染试剂LipofectAMINE 2000 分别加入200 μL 生理盐水中混合，静置5 min，把混有转染试剂的生理盐水加入混有质粒的生理盐水中，静置15 min，均匀地加入培养基中，4 h后补4～6 mL新鲜培养基。

1.5 免疫印迹分析

转染24 h 后收集细胞，加入SDS 上样缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，0.1%溴酚蓝，2%SDS，10%甘油，2.5% β-巯基乙醇），沸水浴10 min，离心10 min 后取上清进行SDS-PAGE，电泳结束后转移至PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h 或4℃过夜，然后加入稀释的Flag 抗体，室温孵育1 h或4℃孵育过夜；用1×TBST洗膜3次，每次5 min，再加入稀释的带有辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，再次用1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后将含有辣根过氧化物酶底物的ECL 滴加至膜上，随即在暗室中压片显影。

表1 引物及序列

1.6 萤光素酶报告基因检测

把HEK293T 细胞接种到6 孔板培养，用无指示剂的白色DMEM培养基培养24 h，等长至60%～80%时进行转染。实验组设立分别为：①pcDNA3-Flag（1 μg/孔）；②pcDNA3-Flag-ERα质粒（1 μg/孔）；③pcDNA3-Flag-ERα（T224A）突变质粒（1 μg/孔）；④pcDNA3-Flag-ERα（S559A）突变质粒（1 μg/孔）。以上组均与ERE-luc 质粒（0.8 μg/孔）、pRL 质粒（0.008 μg/孔）共转，培养基中加入或不加入雌激素（10 nmol/L），共8组，每组设3个复孔。培养24 h后进行萤光素酶报告基因检测。先用1×PBS洗涤细胞2 次，再向各孔中加入100 μL 细胞裂解缓冲液，室温轻摇15 min，把细胞裂解物收集到1.5 mL离心管中，4℃、12 000 r/min 离心5 min，取30 μL 上清用于萤光素酶活性测定。

1.7 统计学分析

实验数据用SPSS13.0统计学软件处理，采用t检验进行统计学分析。显著性概率水平定为P＜0.05。

2 结果

2.1 ERα T224A、S559A突变基因片段的扩增

以pcDNA3-Flag-ERα质粒为模板，通过重组PCR 扩增点突变的上、下游片段。经电泳鉴定（图1），T224A上、下游片段为600～1000 bp，S559A上游约1700 bp，下游约100 bp；再以配对上、下游片段为共同模板，二次PCR扩增出全长的突变基因片段，均约1800 bp。

2.2 ERα T224A、S559A突变质粒构建

将T224A、S559A 突变体扩增产物和pcDNA3-Flag质粒均用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，回收，连接后转入大肠杆菌DH5α，用氨苄西林培养板培养。以阳性克隆菌液为模板，重复PCR 检测质粒中是否含有目的基因片段。电泳结果如图2，PCR 产物约1800 bp，证明质粒上含有目的基因片段。测序结果进一步证明插入片段为ERα突变体片段（序列略）。

2.3 Western印迹检测ERα突变体的表达

图1 琼脂糖凝胶检测PCR扩增ERα突变体产物

分别将pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）及对空载体对照pcDNA3-Flag质粒转染HEK293T细胞，培养24 h后收集细胞，用抗Flag 抗体检测pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的表达，Western 印迹结果如图3。与空载体对照组相比，转染pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的细胞，均显示有一条相对分子质量约66×103的特异性条带，与预期大小吻合，说明pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）在HEK293T细胞中均获得良好表达。

2.4 萤光素酶报告基因检测突变体活性

图2 突变体表达质粒的PCR鉴定

图3 ERα及突变体的Western印迹检测

图4 ERα及其突变体在有或无E2时的转录激活活性检测

将pcDNA3-Flag、pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）分别与ERE-luc 和pRL 共转入HEK293T 细胞，用无指示剂的DMEM培养基培养24 h后收集细胞，行萤光素酶活性检测，结果如图4。无雌激素时，pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的活性分别是pcDNA3-Flag 的1.94、1.49 和1.84 倍（P＜0.05）；与pcDNA3-Flag-ERα（T224A）相比，pcDNA3-Flag-ERα和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的活性明显减低（P＜0.05），pcDNA3-Flag-ERα（S559A）与pcDNA3-Flag-ERα的活性差异不显著（P＜0.05）。有雌激素时，pcDNA3-Flag 活性增加了0.54 倍，pcDNA3-Flag-ERα活性增强了1.57 倍，而pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）活性分别增强了0.54 和0.61 倍，说明在雌激素作用下，pcDNA3-Flag-ERα活性增强明显高于pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）（P＜0.05）。因此，在HEK293T 细胞中，224 位苏氨酸的磷酸化修饰对ERα活性起着重要的作用，同时2 个磷酸化位点对雌激素调节ERα的活性也发挥重要作用。

3 讨论

ERα与乳腺癌的发生、发展、转移和治疗效果密切相关，因此乳腺癌的内分泌治疗主要以ERα介导的通路为靶点，如氟维司群（fulvestrant）抑制ERα的表达；他莫昔芬（tamoxifen）竞争性结合ERα，减少雌激素与ERα结合[14-15]。但在临床上内分泌治疗常常出现耐药性，这些耐药性常与翻译后修饰有关，其中以磷酸化最为常见[2]，因此，研究ERα的磷酸化对探讨耐药机制及药物开发都有重要意义[16-17]。

有关ERα磷酸化的研究很多，已报道有十几个磷酸化位点分布在各个区域，其中研究较透彻的位点有7 个，包括AF1 区的S104、S106、S118、S167，DBD 区的S236，LBD 区的S305 及AF2 区的Y537。前期我们通过质谱分析发现，ERα在DBD 区的224位苏氨酸和可变区的559 位丝氨酸发生磷酸化，而目前关于559位丝氨磷酸化的研究甚少，而224位苏氨酸磷酸化的研究尚无报道。我们通过构建ERα 224 位苏氨酸、559 位丝氨磷酸化位点突变体，利用萤光素酶报告基因活性检测法检测其活性的改变，发现224位苏氨酸突变体活性减弱，而559位丝氨突变体对雌激素调控减弱。这可能与224位苏氨酸处于DBD 区有关，该区主要负责与靶基因启动子的ERE 结合，发生突变后可能与ERE 的结合能力减弱，从而使ERα活性减弱[18]。可变区功能研究尚未清楚，因结构上与AF2区相邻，可能与AF2区有相似的依赖配体调节ERα活性功能。因此，可变区的559 位丝氨突变后，ERα也发生受雌激素调控减弱，但需要进一步研究验证。总之，ERα磷酸化位点突变体的构建及其活性的检测，对ERα的研究有重要意义，对乳腺癌的研究也可提供一定的帮助。

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