席玮芳 高 宏 兰 波 徐旭东 孔任秋



适于沙漠地下水培养的耐碳酸氢钠产油微藻

席玮芳1, 2高 宏1兰 波1徐旭东1孔任秋1

(1. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

产油微藻; 培养; 沙漠地下水; 18S rDNA

能源危机是全世界面临的共同问题, 采用可再生能源替代化石能源是出路之一。生物柴油作为一种清洁可再生能源备受瞩目[1—3]。目前, 生物柴油主要以大豆和油菜、油棕和麻风树等油料植物以及动物油脂、废餐饮油等作为原料。但是动物油脂、废餐饮油原料有限, 而油料植物生产油脂存在占地面积大、生产周期长等缺点, 不宜作为未来生物柴油的主要来源。相比之下, 产油微藻具有生长周期短、单位面积产量高等优点[4], 被认为是生物柴油的下一代原料。由于我国耕地面积逐年减少[5], 北方土地沙漠化严重[6], 利用可耕种土地来培养产油藻显然不符合我国国情, 利用沙漠和盐碱滩涂等不适于耕种的土地作为产油藻规模化培养基地应是我们的选择。大规模培养微藻时, 会利用当地地下水或其他水源添加无机元素配制培养基, 当地的水质可能影响微藻的生长和产油。因此, 在微藻工业化生产前, 有必要利用当地的水配置培养基进行产油藻种筛选。

库布齐沙漠是我国第七大沙漠, 西、北、东三面均以黄河为界, 南部为构造台地, 中部为风成沙丘, 北部为河漫滩地[7]。地下水主要为HCO3-Na、HCO3-Na×Mg型水, 总溶解固体为(0.69—0.97) g/L, 总硬度为(267.15— 3561.45) mg/L[8], 水质盐度偏高。在库布齐沙漠地区的东北部建有达拉特旗荒漠藻综合治沙技术试验站, 本文将从内蒙古一些盐碱地区采集分离得到的一些微藻, 利用试验站内的地下水配制培养基进行培养和油脂含量测定, 筛选生长较快、含油量较高并且可以耐受较高浓度碳酸氢钠的藻株, 以进一步在库布齐沙漠地区进行开放式培养研究。

1 材料与方法

1.1 藻种的来源和培养

藻种来自本实验室从内蒙古各盐碱地区采集并分离纯化得到的46个藻株。使用鄂尔多斯达拉特旗荒漠藻综合治沙技术试验站(位于库布齐沙漠地区的东北部40°22¢23.4²N 109°50¢57.7²E)井水配制的补加0.1 mol/L NaHCO3的BG11[9]培养基(以下称为地下水高碱BG11)培养。

1.2 初步筛选

将各藻株接种于含100 mL地下水高碱BG11培养基的三角瓶中, 初始接种时的光密度值(OD680, 使用MAPADA V-1200 spectro photometer测量, 比色皿光程为10mm)为0.05, 在单侧光强为50 μE/(m2·s)、温度为30℃下静置培养, 每天摇匀3次。观察各藻株的生长情况, 培养至20d, 测定各藻株OD680值以比较细胞浓度, 收集相等量的藻液提取总脂。

藻细胞的总脂利用氯仿/甲醇萃取的方法[10]提取。薄层层析参照文献[11]进行。在薄层层析板(Silica gel 60 F254, Merk KgaA Darmstadt, German)的一端约0.5 cm处点样。以0.02 mg三油酸甘油酯(triolein)标准品(购自Sigma公司)作为参照。展层剂体系为正己烷︰乙醚︰乙酸混合溶液(体积比为70︰30︰1), 层析结束后利用碘蒸气对硅胶板进行染色[12]。

1.3 耐高碱藻的生长及总脂含量测定

将各藻株接种于含有400 mL地下水高碱BG11培养基的三角瓶中, 每株藻设置三个平行, 初始接种时的680为0.05, 在培养温度为30℃、单侧光强为100 μE/(m2·s)条件下通空气培养, 隔天测量680, 绘制生长曲线。当藻液的680超过量程时, 使用ddH2O将其稀释一定的倍数之后再测量, 使测量值在0.1—1.0范围内, 然后根据稀释倍数换算得到实际680值。培养20d后, 收集藻液, 冻干后取100 mg干藻粉提取总脂。总脂的提取参照文献[10]进行, 利用称重法计算总脂含量。

1.4 7株产油藻的显微照片及18S rDNA序列分析

取藻液于载玻片上, 在Olympus BX41型光学显微镜下进行观察、照相。藻株的基因组DNA用CTAB法[13]提取, 以藻株的基因组DNA为模板, 以通用引物18S-1 (5′-tggttgatcctgccagtagtc-3′)和18S-2(5′-tgatccttctgca­gg­tt cacc-3′)[11]进行PCR扩增获得相应18S rDNA片段。用0.7%琼脂糖凝胶电泳和回收试剂盒(购自BioFlux公司)分离、回收和纯化DNA片段, 分别克隆到pMD18-T(购自Takara公司)载体上, 送测序。18S rDNA序列均已提交NCBI GenBank。DNA序列用MEGA 5.0进行对位排列比对, 比对中采取默认设置, 并对比对结果进行手工调整。以三角褐指藻()的18S rDNA作为外类群, 使用软件MEGA 5.0构建邻接树、最大简约树和最大相似树。

2 结果

2.1 藻种初筛

将从鄂尔多斯地区盐碱地分离的46株耐碱产油藻在地下水高碱BG11中培养, 筛选出15株生长较快的藻株, 提取总脂进行薄层层析比较分析。结果发现编号为LB1、NMX451、LB65、LB75和LB96共5株藻的甘油三酯含量明显高于其他藻株, 而LB39、LB52、LB74和LB80明显较低; 其余6株藻LB53、LB60、LB71、LB77和LB89的甘油三酯含量相当, 但LB77和LB89生长慢。显微镜观察又发现LB96藻种不纯, 因此选择LB1、NMX451、LB65、LB75、LB53、LB60和LB71 共7株藻用于进一步试验(见图1有下划线的藻株)。

2.2 7藻株的生长及总脂含量的测定

将以上选出的7藻株在含有400 mL地下水高碱BG11的三角瓶中培养生长, 生长曲线如图2, 总脂含量如表1。生长最快的是LB65, 其总脂含量为30%左右; LB71生长次之, 总脂含量为32%左右。LB53、NMX451和LB60生长较慢, 其中LB60的总脂含量却是7株藻中最高, 为36%±2.06%, LB53和NMX451藻株的总脂均低于30%。LB1和LB75生长速率中等, 总脂含量均高于34%。

箭头所指为甘油三酯; LB1-96, 15株耐高碱绿藻; S. 甘油三酯标样; 带下划线的藻株用于进一步研究

The arrow points to triacylglycerol; LB1-96, 15 NaHCO3-tolerant algal strains; S, triolein. The underlined algal strains were used in further investigations

表1 7株藻在沙漠地下水高碱BG11中的的总脂含量

2.3 7株藻的形态观察和18S rDNA序列分析

通过光学显微镜观察, LB1、LB65和LB75的细胞均为球状, 直径为(3—5) µm; LB53、LB60和LB71的细胞形态成新月形或梭形, 长(6—9) µm, 宽为(2—5) µm; 唯独只有NMX451为椭球形, 长(7—9) µm, 宽为(5—7) µm, 常见2或4个细胞并排分布, 细胞表面具刺或鞭毛状附属物(图3)。对这些藻株的18S rDNA 序列在GenBank中比对, 找到这些藻的相似序列, 以三角褐指藻作为外类群构建分子系统树。不同系统分析方法构建的18S rDNA 系统树具有相似的拓扑结构(图4)。发现LB1、LB65和LB75藻株聚成一簇, 均在小球藻属分支之中; LB53、LB60、LB71和LB96与单针藻种类聚成一簇; NMX451则与链带藻种类聚在一起。结合显微观察和分子系统进化树, 可以确定LB1、LB65和LB75为小球藻属的种类, LB53、LB60和LB71为单针藻属的种类, NMX451为链带藻属的种类。

3 讨论

产油微藻作为生产生物柴油的源料有若干优势, 但在目前技术条件下其生产成本过高, 仍未在生产中得到应用。现有的适合开放式规模养殖的藻种, 包括螺旋藻、杜氏盐生藻和其他一些海洋藻类, 其共同点是可以在较高盐度或pH的培养基中生长[14]。另一方面, 我国耕地面积短缺, 应该利用好沙漠地区发展微藻产业[15]。我们利用在鄂尔多斯盐碱地采集分离的藻种, 以达拉特旗地下水配置的培养液进行产油藻筛选, 获得了一些适应当地水质的藻株。本研究所筛选出的7株藻均为耐碱产油藻, 在大规模培养时更容易具有不易污染的优势。同时, 培养液中存在碳酸氢钠还有利于碳的固定和利用, 可以提高生长速率, 有利于生物质的积累。

从7株微藻的形态和18S rDNA序列可以鉴定出, 有3株隶属于小球藻属, 2株属于单针藻, 还有1株是链带藻。链带藻NMX451是我们最早分离得到的一株耐受碳酸氢钠的产油藻, 在1 m2的跑道池(100 L体积培养液)小规模开放式培养及絮凝采收研究已在另文发表[16]。该藻株在本文描述的生长条件下与以前用武汉地区自来水配置培养液的条件下总脂水平相当, 一般在26%到27%之间。在这些藻株中, 除了两株生长慢总脂含量也较低的LB53和NMX451之外, 其余5株藻显示出生长与总脂含量负相关的趋势。LB65生长最快, 总脂含量在这5株中最低; LB60总脂含量最高, 但生长最慢; LB1、LB71和LB75生长较快且总脂含量较高。通过调整培养基和其他培养条件, 有可能保持LB60较高的含油量而提高其生长, 保持LB65较快的生长速度而提高其含油量, 其余藻株的生长产油能力也可能得到全面的提高。本研究结果显示,从当地盐碱地藻种资源中, 有可能筛选出适合于沙漠地区地下水水质特征的优质产油微藻。

标尺: 10 µm; 1. LB1, 2. NMX451, 3. LB53, 4. LB60, 5. LB65, 6. LB71, 7. LB75

Scale bar: 10 µm. 1. LB1, 2. NMX451, 3. LB53, 4. LB60, 5. LB65, 6. LB71, 7. LB75

节点处的数字为支持率: 邻接树(1000次重复)、最大相似树(100次重复)和最大简约树(1000次重复); 只显示节点上支持率大于50的值。藻株后为NCBI GenBank号

Numbers at the nodes indicate support values: neighbor joining (1000 bootstrap replicates), maximum likelihood (100 bootstrap replicates) and maximum parsimony (1000 bootstrap replicates). Only values above 50% were shown. NCBI GenBank accession numbers are indicated following each algal strain number

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Na2HCO3-TOLERANT OIL-PRODUCING MICROALGAE THAT ARE SUITABLE FOR CULTIVATION WITH DESERT GROUNDWATER

XI Wei-Fang1, 2, GAO Hong1, LAN Bo1, XU Xu-Dong1and KONG Ren-Qiu1

(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Oil-producing microalgae; Cultivation; Desert groundwater; 18S rDNA

10.7541/2015.54

Q949.2

A

1000-3207(2015)02-0414-05

2014-04-14;

2014-06-12

科技基础性工作专项课题中国产油微藻调查(2012FY112900-04)资助

席玮芳(1989—), 男, 江西上饶人; 硕士研究生; 主要从事藻类生物技术研究。E-mail: xiweifang@126.com

孔任秋, E-mail: kongr@ihb.ac.cn