单喜双 岳华梅 陈细华 叶 欢 杨晓鸽 李创举



达氏鲟生长激素基因cDNA克隆、表达及免疫荧光定位研究

单喜双1, 2岳华梅1陈细华1叶 欢1杨晓鸽1李创举1

(1. 中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉 430223; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306)

为研究达氏鲟()生长激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了达氏鲟垂体SMART cDNA, 克隆得到全长cDNA序列。达氏鲟全长cDNA序列为1008 bp, 由52 bp的5′端非编码区(Untranslated region, UTR)、编码214个氨基酸的645 bp开放阅读框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3′UTR构成。运用GH氨基酸序列构建进化树分析发现, 达氏鲟与两栖类、爬行类和哺乳类的一致性要高于真骨鱼类。实时荧光定量PCR结果表明, 达氏鲟mRNA主要在垂体和下丘脑中表达, 且垂体中的表达量约为下丘脑的110倍; Western-blot研究结果与qRT-PCR一致, 仅在垂体和下丘脑中检测到生长激素蛋白, 且垂体中GH的表达量远高于下丘脑。免疫荧光定位结果显示, GH主要定位于垂体中部, 下丘脑中也有少量荧光信号; 苏木精-伊红组织切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生长激素分泌细胞分泌。研究为深入研究脊椎动物生长激素基因的进化和人工养殖达氏鲟的生长调控提供了基础。

达氏鲟; 生长激素; qRT-PCR; Western-blot; 荧光免疫组化

鲟是最古老的脊椎动物之一, 已生存超过2亿年, 具有重要的进化地位。达氏鲟()为我国长江上游特有的淡水定居型鱼类, 与长江中另外两种鲟中华鲟()和白鲟()相比, 其个体较小, 性成熟年限相对较短(雌性5—7龄, 雄性3—5龄)。历史上达氏鲟曾是长江上游重要的经济鱼类之一, 20世纪70年代以来, 由于水利水电工程建设、航运、水体污染和过度捕捞等人类活动的影响, 达氏鲟生存环境遭到严重破坏, 物种处于极度濒危状况, 已于1988年被列为国家一级保护动物[1—3]。目前对于达氏鲟的保护主要采用建立自然保护区、禁渔、增殖放流等方式[4], 取得了一定的成效, 特别是达氏鲟规模化全人工繁殖技术的突破, 对于延续达氏鲟物种有重要意义。但是, 人工养殖达氏鲟仍然面临生长发育较慢和初次性成熟时间较长等问题, 限制了其资源恢复, 寻找合适的方式促进达氏鲟的生长发育对其物种保护和资源利用具有重要的意义。

鱼类生长激素是由腺垂体分泌的一类具有广泛生理作用的单链多肽, 腺垂体分泌的生长激素通过下丘脑-垂体-肝脏生长调控轴, 刺激肝脏分泌胰岛素样生长因子I(IGF-I), 通过IGF-I受体的介导来发挥生物学功能[5—9]。生长激素的分泌受到下丘脑分泌的生长激素释放激素、促性腺激素释放激素和生长激素抑制激素的调控, 研究显示生长激素不仅在鱼类的生长调控方面起主要作用, 与鱼类的生殖[10, 11 ]、免疫[12]、渗透压[13]等生理活动的调节也息息相关。由于生长激素在鱼类生长和发育过程中的重要作用, 引起了科研工作者和渔业生产者的普遍关注, 20世纪80年代中期开始国内外很多实验室对鱼类的生长激素基因进行了研究, 如中华鲟、俄罗斯鲟()、欧洲鳇()、波斯鲟()大马哈鱼()、虹鳟()、草鱼()、南方鲇()、黄鳝()和泥鳅()、鲫()等[14—22]。具有快速生长特征的转生长激素基因鱼于1984年在我国首次诞生[23], 迄今已在世界范围内成功获得了几十种转基因鱼。此外, 利用基因工程方法对外源生长激素基因进行基因重组, 构建原核和真核表达系统, 获得重组生长激素通过投喂或者注射的方式促进鱼类生长的研究也比较多[24]。鱼类生长激素的研究近几十年来在国内外逐渐开展并取得显著进展, 在未来的很长一段时间内仍是热点。

本研究克隆了达氏鲟生长激素全长cDNA序列, 利用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time poly­merase chain reaction, qRT-PCR)和Western-blot方法研究了达氏鲟不同组织中生长激素mRNA及蛋白质水平的表达情况; 随后采用荧光免疫组织化学方法对垂体和下丘脑中生长激素分泌细胞进行定位, 并用HE染色的方式对其分泌细胞进行辨别。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼取自中国水产科学研究院长江水产研究所太湖试验场(湖北荆州), 为全人工繁殖的一龄子二代达氏鲟。分别取肝、脾、心、性腺、脂肪、肾、肌肉、肠、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑等组织, 在液氮中速冻后, 存放于–80℃备用。本研究中所用GH多克隆抗体依据中华鲟GH氨基酸序列制备, 为中国科学院水生生物研究所桂建芳院士赠送。

1.2 总RNA提取、单链cDNA及SMART cDNA合成

总 RNA参照SV Total RNA Isolation System (Promega, 美国)试剂盒说明书提取; 利用PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)试剂盒合成第一链cDNA用于qRT-PCR实验, 按 Super SMART®PCR cDNA Synthesis Kit 操作手册的方法合成达氏鲟垂体SMART cDNA。

1.3 达氏鲟基因全长cDNA克隆及序列分析

参考中华鲟基因cDNA序列(GenBank登录号: EU599640.2)设计引物-F和-R(表1)进行PCR扩增反应, 克隆获得部分达氏鲟cDNA序列, 根据该序列设计特异引物5′-R15′- R23′-F13′-F2扩增cDNA5′端和3′端, 扩增产物纯化后连入pMD19-T载体, 转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α), 挑取阳性克隆测序。利用DNA StarSeqMan软件对获得的基因各片段进行拼接, NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi)对所得序列进行分析, SignalP4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽的预测, 在线进行糖基化位点预测(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ NetNGlyc/), 应用ClustalX 对推导的氨基酸同其他脊椎动物进行比对, 利用DNAMAN 6.0 软件进行氨基酸序列一致性分析, 利用Mega5 软件以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发生树, 自引导检验(Bootstrap)获得系统分支的置信度(重复次数为1000)。

表1 本研究所用引物序列

1.4 实时荧光定量PCR

根据所得到达氏鲟cDNA序列, 设计定量引物RT-和RT-(表 1), 以 1 龄个体的不同组织(心、肝、脾、脂肪、性腺、肌肉、肾、肠、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑)cDNA 为模板进行qRT-PCR反应, 按SYBR®Premix ExTM(Perfect Real Time)试剂盒说明书操作, 实验重复 3 次, 以达氏鲟-为内参基因。扩增反应在 Bio-Rad CFX96TM Real Time System 仪上进行, 反应程序为 95℃预变性10min, 95℃变性 15s, 54℃退火15s, 72℃延伸15s, 共40个循环。

1.5 Western-blot分析

取达氏鲟各种组织加入适量蛋白匀浆缓冲液(100 mmol/L β-磷酸甘油, 20 mmol/L HEPES, 20 mmol/L EGTA, 15 mmol/L MgCl2, pH7.3, 临用前加入1 mmol/L DTT, 2 mmol/L PMSF, 2.5 μg/mL leupetin, 2.5 μg/mL aprotinin), 冰浴匀浆, 离心取上清, 加入Loading Buffer沸水浴10min, 冷却后经SDS-PAGE 蛋白电泳分离, 使用Mini Trans-Blot (Bio-Rad, 美国)电转仪, 将蛋白转至 PVDF 膜(80 V, 0.5h)。TBS溶液(0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris, pH 7.5)漂洗3次, 5%脱脂奶粉封闭(2h), 1︰500稀释中华鲟GH抗体4℃孵育过夜; TBS漂洗3次后加入碱性磷酸酶标记的1︰5000稀释的二抗, 室温孵育1h, TBS漂洗后使用NBT/BCIP避光显色, 选取达氏鲟Adβ-actin为内参蛋白, 实验过程与GH相同, 一抗1︰10000稀释, 二抗1︰1000稀释。

1.6 荧光免疫组化及组织学观察

达氏鲟脑组织样品用4%多聚甲醛固定, 常规脱水透明处理, 石蜡包埋, 横向连续切片, 厚度约为4 μm, 荧光免疫组化与HE染色选用邻近切片。选取石蜡切片脱蜡后HE 染色, 光学显微镜观察拍照。荧光免疫组化石蜡切片脱蜡后, PBS洗三次, 每次5min; 抗原修复液煮沸10min, 自然冷却至室温, PBS洗三次, 每次5min; 3%过氧化氢37℃下处理30min, PBS洗三次, 每次5min; 5%脱脂奶粉封闭1h, 添加一抗(1︰200)处理, “湿盒”过夜; PBST洗5次, 每次10min, PBS洗两次, 每次10min; 以2%正常羊血清稀释FITC标记的羊抗兔血清(1︰100), 在室温条件下避光孵育1h; PBS洗5次, 每次10min, DAPI(1︰1000)染色30min; PBS洗5次, 每次10min, 最后用抗淬灭剂封片, 荧光显微镜下观察、拍照。

2 结果

2.1 达氏鲟全长cDNA及推导的氨基酸序列

分别以3尾达氏鲟垂体SMART cDNA为模板, 扩增出的达氏鲟cDNA全长序列完全一致, 利用Blast软件与GenBank中已知的序列进行同源性比较, 结果证实所得序列为的cDNA。cDNA序列全长1008 bp, 包含52 bp的5′UTR和311 bp的3′UTR, 其开放阅读框ORF为645 bp, 编码214个氨基酸, 相对分子质量约为24 kD。根据SignalP4.1预测, 其多肽前24个氨基酸为信号肽, 成熟肽包含190个氨基酸, 在氨基酸序列中存在一个潜在的N-糖基化位点(Asn-Cys-Ser)和4个半胱氨酸Cys残基, 形成2个二硫键(GenBank登录号: KJ650095)。

2.2 达氏鲟GH氨基酸序列一致性分析及系统进化树的构建

将推导的达氏鲟GH氨基酸序列与其他代表性脊椎动物相应序列进行多重比对, 结果表明, 达氏鲟与其他几种鲟形目鱼类的GH氨基酸序列一致性最高, 均达到95%以上。达氏鲟GH与两栖类非洲爪蟾()、爬行类的棕树蛇()、鸟类的鸡()及哺乳类的人()和小鼠()相应序列一致性均超过50%, 而与几种真骨鱼类的一致性较低, 为40%—45%。运用Mega 5软件构建了基于GH氨基酸序列的NJ系统发育树(图1), 结果表明, 以高等脊椎动物(两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类)为外群, 可识别出2个单系类群: 7种鲟形目鱼类聚为一类; 3种真骨鱼类和1种软骨鱼类聚为一类。

2.3 达氏鲟mRNA的组织表达特征

选择达氏鲟-作为内参基因, 采用real-time qPCR方法检测了达氏鲟mRNA在达氏鲟垂体、下丘脑、心、肝等不同组织中的表达情况, 熔解曲线显示为单一峰值, 表明无非特异性扩增和引物二聚体。结果发现,mRNA仅在垂体和下丘脑中表达, 垂体GH表达量约为下丘脑中的110倍, 而在其他检测的组织中无表达(图2)。

2.4 达氏鲟GH蛋白的组织表达

采用Western-blot方法检测了达氏鲟GH蛋白在垂体、下丘脑、心、肝等不同组织中的表达情况。与mRNA的组织分布一致, GH蛋白仅在垂体和下丘脑中表达, 且垂体中GH蛋白的表达量明显高于下丘脑(图3)。

A. 达氏鲟脑组切片位置示意图; B. 垂体及下丘脑荧光免疫组化图片, B1和B2分别为下丘和垂体部分区域放大, GH抗体利用FITC绿色荧光标记, 蓝色荧光DAPI标记细胞核; C. 下丘脑及垂体组织HE染色, C1为局部区域放大图、C2和C3分别为下丘脑和垂体部分区域放大, 图中强嗜酸性细胞(胞质红色)为生长激素分泌细胞; Pi. 垂体; Hy. 下丘脑; 图中标尺单位为μm

Schematic drawing of a sagittal section of the brain ofshowing the location of the transverse section (A); Immunofluorescence signals stained with anti-Growth Hormone (GH) antiserum, showing GH immunoreactive cells in the pituitary and hypothalamus (B). The pituitary and hypothalamus stained with Harris’s hematoxylin and eosin (C); Pi. pituitary; Hy. Hypothalamus; Bar μm

2.5 达氏鲟GH分泌细胞的定位

将达氏鲟脑组织整体固定后, 横向连续切片, 切片位置如示意图4A所示, 荧光免疫组化及HE染色试验选用临近切片。荧光免疫组化显示, 达氏鲟下丘脑(图4B、4B1)和垂体(图4B、4B2)中存在对GH抗体强烈的特异性免疫反应, 信号明显, 下丘脑及垂体中具有特异性信号的细胞形态一致。与垂体中(图4B2)信号细胞排列比较密集相比, 下丘脑中(图4B1)信号细胞分布比较分散且数量较少。HE染色辅助定位生长激素分泌细胞(图4C、4C1、4C2、4C3), 生长激素分泌细胞含有致密的嗜酸性细胞质, 易被伊红着色, 在垂体(图4C3)和下丘脑内(图4C2)分布着强嗜酸性细胞, 区域位置与荧光免疫组化中的特异性信号细胞一致, 可以确定为生长激素分泌细胞。

3 讨论

本研究从达氏鲟垂体中扩增获得达氏鲟的全长cDNA序列, 该序列编码214个氨基酸, 与其他已报道的几种鲟鱼GH序列一致。对不同脊椎动物GH蛋白氨基酸序列进行比对发现, 从低等的鱼类至高等的哺乳类, Cys残基的数目和位置都是一致的, 可形成2个二硫键, 这对GH蛋白的正确折叠、特定空间结构维持及生物学活性的实现起重要作用。在达氏鲟GH氨基酸序列中发现一个潜在的N-糖基化位点, 值得关注的是在所有参与序列分析的鲟形目鱼类、软骨鱼类、真骨鱼类、甚至还有两栖类的非洲爪蟾及鸟类的鸡中相同区域存在完全一样的潜在糖基化位点“NCT”, 符合经典的三联子N-糖基化序列Asn-X-Thr/Ser; 而在哺乳类的人、鼠及爬行类的棕树蛇中, 没有符合经典N-糖基化的序列。三种真骨鱼类除“NCT”外, 还存在“NDS”这一潜在的糖基化位点, 糖基化位点在蛋白分泌到细胞表面的过程中起到信号的作用, 是生物体内最为重要的蛋白质翻译后修饰形式之一[25, 26], 不同物种间的差别可能是由于进化或功能分化造成的。

生长激素基因是一个相对保守的基因, 其序列结构具有高度进化分类意义, 将达氏鲟GH的氨基酸序列与其他几种脊椎动物比对分析显示, 不同类群的一致性差异较大, 其中达氏鲟与生境部分重叠的中华鲟氨基酸序列的一致性高达98%, 与其他几种鲟形目鱼类相比一致性也在95%以上, 表明GH在鲟形目鱼类中高度保守。值得关注的是达氏鲟GH氨基酸序列同两栖类的非洲爪蟾、爬行类的棕树蛇、鸟类的鸡、哺乳类的人和鼠的一致性要高于几种真骨鱼类, 这与在中华鲟[14]、欧洲鳇和俄罗斯鲟[15]、波斯鲟[16]中的研究类似, 表明了达氏鲟作为一种比较原始的鱼类, 在遗传上与四足类脊椎动物的亲缘关系要近于真骨鱼类。将达氏鲟与其他几种鲟形目鱼类、真骨鱼类、软骨鱼类和两栖类、爬行类、鸟类、哺乳动物进行了同源性聚类分析,能得到同样的结论, 达氏鲟作为硬骨鱼类家族中古老的物种, 研究其进化过程具有重要意义。

鱼类生长受到遗传、营养和内分泌等多种因素的调控, 而遗传及营养因素主要是通过内分泌途径影响生长。目前已知调控鱼类生长的内分泌轴主要为下丘脑-垂体-肝脏生长调控轴, 垂体处于鱼类生长内分泌调控系统的核心位置, 垂体分泌的生长激素通过血液循环运送到肝脏及其他靶器官, 靶器官受到刺激后胰岛素样生长因子(IGF-I)得以表达, 进而发挥生物学功能。除垂体外, 在包括鱼类在内的脊椎动物中还发现有垂体外组织存在GH的表达[27—30], 生长激素在神经系统、免疫系统、生殖系统、消化系统、呼吸系统内, 在皮肤里、在骨骼中甚至在心血管系统内都能检测到它的表达, 它的功能和作用不仅仅是靠内分泌的方式所体现, 还能够通过自分泌或旁分泌的方式发挥生理功能。本研究利用real-time qPCR和western-blot技术从mRNA和蛋白质水平来了解生长激素在达氏鲟组织中的表达特征, 结果表明mRNA及蛋白在垂体和下丘脑中表达。下丘脑在空间距离和功能作用上与垂体联系紧密。在对小鼠的研究中也发现生长激素在下丘脑中存在表达, 可能参与了对脑的功能的调控[26]。在本研究中除下丘脑和垂体外并未在其他组织中检测到mRNA和蛋白的表达, 而GH在不同组织中的表达和性别、年龄及生长发育情况都有一定关系。本研究试验鱼为1龄幼鱼, 可能存在幼鱼期垂体中GH的合成和分泌非常旺盛, 通过GH-IGFI轴刺激肝脏合成的IGF水平比较高, 从而抑制了垂体外各组织中GH的表达, 不同年龄、性别和生长发育情况达氏鲟GH表达特征还有待于进一步研究。

垂体是鱼类重要的内分泌腺体, 参与鱼类生长、发育、生殖和渗透压等各种生命活动的调控。GH、促性腺激素(GtH)、促甲状腺激素(TSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、催乳激素(PRL)、生长催乳素(SL)和黑色素细胞刺激激素(MSH)共同组成了鱼体的腺垂体激素, 它们由不同的分泌细胞分泌, 其分布特征在不同种鱼间是相似的[31—33]。针对几种分泌激素的腺垂体细胞的研究手段主要有常规染色、免疫组织化学及免疫荧光标记等方法, 本研究利用中华鲟GH抗体进行荧光免疫组织化学研究, 生长激素抗原能够特异性的识别抗体而得以定位, 常规HE染色辅助定位生长激素分泌细胞, HE染色生长激素分泌细胞呈强嗜酸性, 两种定位方式选择相近切片, 细胞区域位置一致, 形态一致, 共同定位了垂体和下丘脑中的生长激素分泌细胞(图4), 得出的结果与其他研究一致[31—33]。

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cDNA CLONING, EXPRESSION AND IMMUNOLOCALIZATION OF GROWTH HORMONE GENE IN

SHAN Xi-Shuang1, 2, YUE Hua-Mei1, CHEN Xi-Hua1, YE Huan1, YANG Xiao-Ge1and LI Chuang-Ju1

(1. Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation, Ministry of Agriculture of China, Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2.College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The Dabry’s sturgeon (Dumeril, 1868) mainly distributes in the upper Yangtze River of China. It is currently endangered due to the destruction of their spawning grounds and other anthropogenic interferences. In this study, the full-length cDNA sequence ofwas cloned from SMART cDNAs of pituitary in. The Dabry’s sturgeoncDNA was 1008 bp in length, including a 52 bp 5′-untranslated region (UTR), a 311 bp 3′ UTR and a 645 bp open reading frame (ORF) encoding a peptide of 143 amino acids. Amino acid sequence alignment revealed thatGH shared extremely high identities (over 95%) with its counterparts in other sturgeons. Moreover, sturgeons showed lower GH sequence identities with other bony fish than that of Amphibia, Reptilia, Aves, and Mammalia. By quantitative real-time PCR,mRNAs were detected in the pituitary and hypothalamus but absent in any of other somatic organs examined. Moreover, the expression ofmRNAs in the pituitary was about 110 times to that of hypothalamus. Western-blot analysis suggested the GH expression in both the pituitary and hypothalamus, with higher expression level in the pituitary, which is consistent with the result of qRT-PCR. Immunofluoresence locali­zation showed strong GH-positive signals in the pars intermedia of the pituitary, together with weak fluorescence signals detected in the hypothalamus. HE staining indicated that GH was mainly secreted by eosinophilic cells in the adenohypophysis. This study will benefit both the evolution study of vertebrategenes and the further biological function study of GH in cultured.

; Growth hormone; qRT-PCR; Western-blot; Immunolocalization

10.7541/2015.41

Q344+.1

A

1000-3207(2015)02-0307-08

2014-04-25;

2014-09-22

国家高技术研究发展计划项目课题一(2011AA100401); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2013JBFZ01); 国家自然科学基金青年科学基金项目(31001104)资助

单喜双(1989—), 男, 吉林扶余人; 硕士研究生; 主要研究方向为鱼类分子遗传。E-mail: s9shanxishuang@126.com

李创举, 博士, 副研究员, 硕士研究生导师; E-mail: lcj@yfi.ac.cn