龙海 ，李芳荣，李一农，凌杏园，谢泳桂，冯建军，郑耘，刘亮山

1.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518001；2.深圳市检验检疫科学研究院 深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518045

检测技术和方法是口岸植物线虫检测工作中的一个重要环节，关系到能否将检疫性线虫挡在国门之外，不会对我国的生态环境以及林业、农业生产等造成严重危害。目前口岸常用的线虫检测方法是形态学方法，有时也会结合一些基于PCR 的分子生物学方法。形态学方法要求检测人员有丰富的形态学知识以及多年的检测经验，而且对虫态的要求比较严格，有时需要雌虫才能鉴定，对于幼虫往往无法鉴定。而基于PCR的分子生物学方法有时会有假阳性或假阴性的问题出现，如果要进行测序，所需费用也比较高，周期也比较长。为了弥补上述两种方法的不足，在满足口岸快速通关要求的同时提高植物线虫的检测质量，需要尝试新的检测技术和方法。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术的发展为植物线虫检测提供了新的手段。其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，而使生物分子电离，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（m/z）与离子的飞行时间成正比。MALDITOF MS 具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段[1]。近年来，该技术逐渐被用于植物细菌、真菌和线虫的检测中。Stets 等[2]对小麦根部分离的细菌进行了质谱分析，能很好地区分这些细菌菌株。Horká等[3]应用质谱技术对链核盘菌属的4 个种进行了鉴定，能准确地将这4 种真菌区分开。Ahmad 等[4]利用MALDI-TOF MS 能很好地区分南方根结线虫的单条幼虫和雌虫这两种不同的虫态，但样品的前处理很难。Perera 等[5]利 用MALDI-TOF MS 技术成功地鉴定了小麦种瘿线虫，但是线虫样品用量大。

本研究提供了一种用于MALDI-TOF MS 检测单条植物线虫的方法，和已有方法相比，该方法对于线虫的前处理容易操作，所需样品量少，具有结果稳定、背景信号低、灵敏度高等优点。

1 材料与方法

1.1 供试样品

本研究所用样品系香港入境旅检时被截获，经形态学鉴定为短体线虫（Pratylenchusspp）。将分离到的短体线虫转移到1.5 mL Eppendorf 管中，轻微涡旋5 min，4000 r/min离心10 min，去上清液；加入1 mL 灭菌水，轻微涡旋5 min，4000 r/min 离心10 min，去上清液，此步骤重复3次[4]。

如果分离到的线虫量少，可以滴加3 滴灭菌水到载玻片上，挑取单条线虫到第一滴水中清洗，再挑到第二滴水中清洗，最后挑到第三滴水中清洗。

1.2 其他材料

溶剂乙腈、甲酸、三氟乙酸（TFA）为色谱纯，购自Sigma 公司；标准品Peptide Calibration Standard、Protein Calibration StandardⅠ和基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）购自Burker公司；质谱仪为Burker公司的MALDI-TOF-microflex。

1.3 基质溶液配制

乙腈、水和10% TFA 按体积比2∶1∶1 混合，加入CHCA至过饱和。基质溶液须现用现配。

1.4 蛋白标准样品配制

取990 μL 50%乙腈与10 μL 10% TFA 混匀，取125 μL 混合液加至1 管Peptide Calibration Standard 中，混匀；取125 μL 混合液加至1 管Protein Calibration StandardⅠ中，混匀；从上述2 管中各取等体积的溶液混匀配制成蛋白标准样品，用30%的乙腈按1/5 稀释蛋白标准样品，分装至灭菌PCR 管中，每管5 μL，-20℃保存。

1.5 样品前处理及加样

载玻片上滴加5 μL 70%甲酸和乙腈的等体积混合液；在体视显微镜下挑取一条清洗好的线虫，转移到载玻片的混合液中，压破线虫；用移液枪吸取1.5 μL 混合液（连带线虫一起），滴加到MALDITOF MS 样品板上；取1 μL 蛋白标准样品滴加到MALDI-TOF MS 样品板上；溶液晾干后加1 μL CHCA基质溶液；晾干后备用，每个样品重复3次。

1.6 质谱分析

采用波长337 nm的氮激光源，线性阳离子检测模式，20 000 V 加速电压，延迟时间400 ns，激光强度2200，每个样品点激光随机射击60 个点，每次射击100 次。m/z 采集范围2000～20 000 D，使用标准品对仪器进行校准并作为阳性参照物。每个样品的3个质谱图叠加后作为样品的质谱图。

2 结果

采用MALDI-TOF MS 对单条短体线虫的雌虫和二龄幼虫（J2）分别进行了分析。结果显示（图1），经过清洗和前处理，短体线虫的雌虫和J2 的质谱图都出现了较多的离子峰，图谱基线平滑。雌虫稳定重复出现的质谱峰值分别为m/z 2790、2970、3326、4373、4872、5654、7000、9579 和19161，J2 稳定重复出现的质谱峰值分别为m/z 2185、2790、3036、3326、4063、4373、4929、5380、6999 和11156。对比雌虫和J2 的质谱峰值，在±0.1%的误差范围内，相同的峰值分别为m/z 2790、4373 和7000，其余峰值分别为各自的特征峰。从结果可以看出，MALDI-TOF MS 能够区分出短体线虫的不同虫态。

3 讨论

传统的形态学方法结合PCR为基础的分子生物学方法，是目前口岸植物线虫检疫常用的方法。这种方法有时满足不了口岸“检得出、检得准、检得快”的要求。形态学方法难以鉴定幼虫，分子生物学方法有时会产生假阳性或假阴性，如果要测序，会延长检测周期。MALDI-TOF MS 具有快速、灵敏度高、分辨率高、准确度高等特点，目前国际上有两家实验室用该方法检测植物线虫[4-5]。Perera 等[5]用质谱技术鉴定了大量小麦种瘿线虫，给出了鉴定的特征峰。Ahmad 人[4]对南方根结线虫的单条幼虫和雌虫进行了质谱分析，发现它们有一个相同的质谱峰，雌虫有4个特征峰，幼虫有7个特征峰。这两个实验证明MALDI-TOF MS 能够用于植物线虫种的鉴定，以及区分种内不同的虫态。

图1 单条短体线虫的蛋白质指纹图谱

在植物线虫检疫工作中截获的线虫量较少，往往只能对单条线虫进行检测。在实验中笔者发现，Ahmad[4]处理单条线虫的方法难以操作，很难把单条线虫直接挑到MALDI-TOF MS 样品板上。因此，我们对单条线虫的前处理和加样方法进行了改进，提高了蛋白的提取效率，得到比较好的结果，图谱基线平滑，离子峰较多，特征峰明显。MALDI-TOF MS检测植物线虫耗时短，从样品清洗到得出结果不超过2 h；检测灵敏度高，能够检测单条线虫；结果稳定性好，多次重复试验的结果复现性好。缺点是前期投入大，仪器较昂贵；鉴定植物线虫需要建立相关的数据库，目前植物线虫的数据库比较缺乏。但是，随着质谱技术的不断成熟、仪器成本的降低、相关数据库的不断完善，不久的将来MALDI-TOF MS 将会像PCR技术一样有望成为植物线虫鉴定的利器。

[1]冯建军,龙海,刘新娇,等.MALDI-TOF 质谱技术鉴定植物病原体研究进展[J].植物检疫,2014,28(6):13-18.

[2]Stets M I,Pinto A S,Huergo L F,et al.Rapid identification of bacterial isolates from wheat roots by high resolution whole cell MALDI-TOF MS analysis[J].J Biotechnol,2013,165(3-4):167-174.

[3]Horká M,Kubesová A,Salplachta J,et al.Capillary and gel electromigration techniques and MALDI-TOF MS-suitable tools for identification of filamentous fungi[J].Anal Chim Acta,2012,716:155-162.

[4]Ahmad F,Gopal J,Wu H F.Rapid and highly sensitive detection of single nematode via direct MALDI mass spectrometry[J].Talanta,2012,93:182-185.

[5]Perera M R,Vanstone V A,Jones M G.A novel approach to identify plant parasitic nematodes using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19:1454-1460.