罗森，齐芬芳，宫路路，刘昊，李涛，王慧

1.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563002；2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭状芽孢杆菌在厌氧环境中产生的外毒素，是目前已知毒性最强的一种生物毒素，对人的致死量约为0.1 μg。根据肉毒毒素抗原性的不同，分为7 个血清型（A～G），人类的肉毒中毒主要由A、B 和E 型引起[1]，其中以A 型肉毒毒素（BoNT/A）中毒更为常见，且相比其他型可引起更严重的症状和导致更高的死亡率。肉毒毒素的相对分子质量（Mr）约150×103，由N 端的一条Mr约50×103的轻链（light chain，LC）和C端的一条Mr约100×103的重链（heavy chain，HC）通过二硫键联结在一起，具有锌离子依赖的催化活性结构域位于毒素的LC 中[2-3]。肉毒毒素的致病机制是由HC 结合到后胆碱神经能细胞并易位通过细胞膜进入神经细胞释放出LC[4-6]。作为一种锌内肽酶，LC 选择性切割神经细胞内的底物SNARE蛋白，每个血清型的BoNT轻链都切割特异的底物蛋白，A 和E 型切割SNARE 蛋白中的SNAP-25[2-4]，其中BoNT/A裂解SNAP-25（裂解肽键Q197-R198）。这些具有神经毒力的内肽酶通过裂解SNAP-25 从而阻断神经递质乙酰胆碱的释放，引起肌肉松弛麻痹、呼吸肌麻痹甚至导致人畜中毒死亡。在我国许多省区时有A型和B型肉毒中毒病例发生。同时，A型肉毒毒素也越来越多地被应用于美容和一些神经疾病的治疗中[10-13]。

由于肉毒毒素的稳定性差和具有剧毒性，若对其操作将面临潜在的健康危害甚至生命危险，同时，目前尚无法有效地使肉毒毒素的LC和HC分离。如能经济高效地得到有活性的稳定的肉毒毒素LC，则可避免上述问题，并可作为试剂应用于肉毒毒素酶类抑制剂高通量检测方法的研究、食品卫生、进出口检疫检验，以及对美容医疗用肉毒毒素的活性分析和检测。我们通过基因克隆技术，从A 型肉毒梭菌中调取BoNT/A LC 基因，在大肠杆菌中重组表达，通过SDS-PAGE 对重组蛋白进行鉴定，亲和纯化后，利用底物SNAP-25分析了重组蛋白的催化活性。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）Rosetta 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；A 型肉毒梭菌、pET-32a 表达质粒由本室保存；BoNT/A、底物SNAP-25 由本室制备保存；DNA marker、蛋白质相对分子质量标准、质粒小提试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ购自New England Biolabs 公司；IPTG购自Promega 公司；引物合成及基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；HisTrap FF 柱（5 mL）购自GE Healthcare公司。

1.2 引物设计与合成

根据GanBank 中A 型肉毒毒素序列（GenBank：M30196.1）中的LC 片段及载体序列，设计合成上游引 物P3（5'-CCATGGCTTATAAAGATCCTGTAAAT GGTGTT-3'）和下游引物P4（5'-CTCGAGTAATCTA GTAAAATTCCTGCTGTT-3'），上、下游引物中分别引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点（下划线部分）。

1.3 目的基因的克隆和原核表达载体pET-32a-BoNT/A LC的构建与鉴定

将培养的A 型肉毒梭菌菌体离心，用50 μL 0.01 mol/L 的Tris-HCl（pH7.4）重悬菌体，加入50 μL 0.5 mol/L 的KOH，96℃加热10 min，加入100 μL 0.5 mol/L 的Tris-HCl（pH6.5），12 000 r/min 离心10 min，取上清10 μL 作为模板进行PCR 扩增。PCR 扩增体系（25 μL）包括H2O 17.5 μL，Taq酶缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。PCR 扩增条件：95℃3 min；94℃30 s，53℃40 s，72℃1.5 min，30次循环；72℃延伸10 min。用凝胶回收试剂盒回收PCR 扩增产物，连接T 载体后转化大肠杆菌DH5α，PCR 鉴定的阳性重组质粒用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，回收BoNT/A LC 片段，与经同样双酶切处理的pET-32a 载体用T4DNA 连接酶连接，构建成BoNT/A LC的原核表达载体pET-32a-BoNT/A LC，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性菌落，提取质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定。

1.4 BoNT/A LC重组蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta 感受态细胞，挑选阳性菌落接种于含氨苄西林（100 mg/L）的LB 培养基中，37℃过夜培养，以1∶100 转接于LB 培养基中，37℃振荡培养至D600nm为0.6左右，加入IPTG 至1 mmol/L，20℃继续培养20 h，4℃、6000 r/min 离心20 min 收集菌体。用结合缓冲液（A 液）重悬菌体，放置冰上进行超声波破碎30 min，4℃、12 000 r/min 离心20 min，SDSPAGE分析上清和沉淀中的目的蛋白。

1.5 BoNT/A LC重组蛋白的纯化

取细菌培养液，4℃、6000 r/min 离心收集菌体，重悬于结合缓冲液（20 mmol/L 磷酸钠，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L 咪唑，pH7.0）中，超声波破碎处理后取上清上样HisTrap FF 柱，用10 个柱床体积的结合缓冲液平衡柱子，然后用洗脱缓冲液（20 mmol/L 磷酸钠，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪 唑，pH7.4）线性梯度洗脱；收集洗脱液洗脱的样品行SDS-PAGE分析；采用Bradford法对纯化产物进行定量测定；纯化后的重组蛋白透析于缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH7.5）中，于-20℃保存备用。

1.6 BoNT/A LC重组蛋白的活性验证

在反应 液（50 mmol/L HEPES，2.5 mmol/L DTT，10 μmol/L ZnCl2，pH7.4）中，将重组蛋白BoNT/A LC 与SNAP-25 于37℃反应30 min，同时设定一组不加BoNT/A LC 作为阴性对照。对BoNT/A LC的活性进行20% SDS-PAGE 后，考马斯亮蓝染色检测切割情况。通过BoNT/A LC（10 nmol/L）切割2～100 μmol/L 不同浓度的SNAP-25 测定动力学参数，切割反应时间为20 min，加入SDS-PAGE 上样缓冲液终止反应，将SDS-PAGE 胶用Chemi Doc XRS 成像系统（BIO-RAD）采用光密度分析法测定切割和未切割SNAP-25蛋白所占百分比。

2 结果

2.1 BoNT/A LC的基因克隆和表达质粒的构建

PCR 扩增获得BoNT/A LC 基因片段，与预期大小（1221 bp）相符（图1），测序显示与GenBank 中报道的基因序列一致性为99%。用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pET-32a-BoNT/A LC，产物大小与PCR 结果一致，提示目的基因正确插入pET-32a 表达载体中（图1）。

2.2 重组蛋白BoNT/A LC 在大肠杆菌中的诱导表达与纯化

将鉴定正确的pET-32a-BoNT/A LC 质粒转化表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta 感受态细胞，在1 mmol/L IPTG 的诱导下进行表达。SDS-PAGE分析显示，与未诱导菌相比，诱导菌有明显表达条带，相对分子质量约为70×103，与预期相符（图2）。SDS-PAGE 分析重组蛋白经HisTrap FF 柱纯化后的产物，目的条带较为单一，纯度在90%左右，表明得到较高纯度的目的蛋白（图3）。

2.3 重组蛋白BoNT/A LC的活性检测

BoNT/A LC 可特异性识别、裂解其底物SNAP-25 蛋白的Q197-R198，将10 nmol/L 重组蛋白BoNT/A LC 与SNAP-25 在反应液（50 mmol/L HEPES，2.5 mmol/L DTT，10 μmol/L ZnCl2，pH7.5）中于37℃孵育，每2 min 检测一次，SDS-PAGE 分析结果见图4，BoNT/A LC 酶解SNAP-25 后产生了与预期相符的2条蛋白片段，说明重组蛋白BoNT/A LC 能特异性酶解底物SNAP-25。动力学参数测定表明，BoNT/A LC 酶解SNAP-25 的Km和kcat值分别为0.96±0.05 mmol/L和0.09±0.01 s-1。

图1 BoNT/A LC基因PCR产物和

图2 重组BoNT/A LC在大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta中的表达

3 讨论

对于肉毒中毒，迄今国内外尚未有较满意的解毒药物，仅有的马血清抗毒剂存在易产生免疫反应副作用等缺点。LC 已被证实是治疗肉毒毒素中毒的关键药靶，开发高效的BoNT LC 抑制剂是当前研究的热点领域[14-21]。在基于肉毒神经毒素活性的分析方法中，小鼠生物检测仍是目前惟一被公认的确认BoNT 的方法[22]。但小鼠生物检测本身也有缺点，如检测花费时间较长、使用小鼠的检测成本较高、对大批量的样本进行检测存在困难等。针对BoNT LC抑制剂开发的大量样本的初步筛选，建立高通量的体外检测方法能够极大地减少检测时间和工作量。本研究的目的是以BoNT LC 代替BoNT 作为试剂，应用于BoNT LC抑制剂高通量体外检测方法研究。

我们在重组BoNT/A LC 蛋白的C端加上组氨酸标签，利用HisTrap FF柱进行亲和纯化，通过一次过柱纯化得到高纯度的目的蛋白，纯化方法简单容易。为了提高目标蛋白的表达产量，我们选择携带稀有密码子的表达菌株BL21（DE3）Rosetta，发现其比BL21（DE3）的表达量更高，重组蛋白达到全菌蛋白总量的20%；采用20℃低温诱导并延长诱导时间，比37℃诱导时的表达量提高50%以上，且包涵体更少，可能是由于低温条件下更有利于该蛋白的表达和正确折叠，表达的目的蛋白绝大部分存在于超声波破碎后的上清中。酶活分析证明所制备的重组蛋白的酶活性略高于全毒素，这可能是由于全毒素中LC 的活性部位被包围在HC 的易位域带中，而单独的LC 比全毒素中的LC 可暴露更多的活性位点。曾有类似结果报道[21]。

图3 重组BoNT/A LC蛋白的纯化

图4 SDS-PAGE分析BoNT/A LC与SNAP-25的反应

综上，本研究构建的表达菌株能够高表达重组BoNT/A LC，获得的BoNT/A LC 重组蛋白具有高活性、高稳定性，容易制备且安全无毒，可用于后续研究。这为BoNT/A LC 抑制剂高通量体外检测方法的研究和BoNT/A LC抑制剂的筛选奠定了基础。

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