李倩，孙鹏，杨建林，曹春雨，王艳林

三峡大学 医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002

鼠黑色素瘤相关抗原（melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART1）又称Melan-A，主要存在于正常黑色素细胞或恶性黑色素肿瘤细胞中。作为一种特征性黑素瘤肿瘤抗原，MART1 的表达异常与恶性黑色素瘤发生与发展密切相关[1-2]。最新研究表明，MART1 中的抗原肽能够被T 淋巴细胞识别并激发强烈的CTL 反应，提示MART1在黑色素瘤特异性免疫治疗中潜在的应用价值[3-6]。我们拟在大肠杆菌中原核表达和纯化MART1蛋白，并以此为抗原制备高效价的兔抗鼠多克隆抗体，以为MART1在抗肿瘤免疫治疗中的应用研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

日本大耳白兔（雄性，2 kg）购自湖北省实验动物中心；鼠黑色素瘤B16-F1 细胞株、大肠杆菌Rosseta（DE3）、质粒载体pET32a 为本实验室保存；TRIzol 总RNA 纯化试剂由Introvogen 公司提供；TaqDNA 聚合酶、限制性内切酶由Thermo 公司提供，Ni-NTA蛋白纯化树脂购于Qiagen公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗β-actin 和抗His 标签单抗购自Sigma 公司；Rodamine 标记的山羊抗小鼠IgG 为北京中杉金桥公司产品；HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 多克隆抗体购自武汉博士德公司；PCR 引物合成及DNA测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。

1.2 RT-PCR克隆小鼠MART1 cDNA

用TRIzol 试剂提取小鼠B16-F1 黑素瘤细胞总RNA，以该RNA 为模板、Oligo（dT）为引物，经逆转录酶M-MLV 催化，将mRNA 逆转录成cDNA 第一链，再以此cDNA 第一链为模板，用PCR 技术扩增出MART1 双链DNA 编码序列。PCR 上下游引物序列分别为5'-CGGAATTCATGCCCCAAGAAGACACAT TCA-3'和5'-AGCAAGCTTTCTCAGGGTGAATAAG GTGG-3'，在上下游引物的5'端分别引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ（引物序列中下划线部分）以便随后的克隆操作。PCR 产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入pET32a 原核表达载体，用酶切和DNA测序鉴定所得重组质粒pET32a-MART1 中插入DNA序列和方向的正确性。

1.3 MART1的原核表达、纯化及鉴定

用质粒pET32a-MART1 转化大肠杆菌Rosseta（DE3）感受态细胞，培养至细菌处于对数生长期时，加入IPTG 至终浓度为0.3 mmol/L，诱导细菌表达重组蛋白5 h；离心收集诱导后的菌体，用裂解缓冲液（10 μmol/L 咪 唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4）重悬沉淀，超声波裂解后取上清，上清中的MART1 重组蛋白用Ni-NTA 树脂亲和层析分离，咪唑浓度梯度洗脱获得初步纯化的MART1重组蛋白，再用制备性PAGE 进一步纯化。用Western 印迹鉴定MART1 重组蛋白：样品经SDS-PAGE 分离后电转至PVDF膜，膜用5%脱脂牛奶封闭1 h，与1∶1000稀释的鼠源His 标签抗体共孵育，低速摇床上4℃过夜，再与1∶5000 稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG 室温共孵育1 h，ECL显影指示目标蛋白。

1.4 MART1多克隆抗体的制备

用纯化的MART1 蛋白免疫雄性日本大耳白兔。首次免疫剂量500 μg/只，与等量弗氏完全佐剂混合后于脊柱两旁皮下注射；间隔10 d 后进行第二次免疫，注射剂量为100 μg/只，与等量弗氏不完全佐剂混合后皮下注射；10 d 后同样方法进行第三次免疫；第三次免疫1周后颈静脉取血，分离血清。

1.5 ELISA检测抗体效价

以纯化的MART1 蛋白（2 μg/孔）为包被抗原，一抗为本实验中制备的梯度稀释的兔抗血清，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5000稀释），TMB显色，全波长酶标仪检测光密度（D450nm）。

1.6 Western印迹检测抗体的特异性

蛋白样品包括IPTG 诱导前、后的大肠杆菌菌液，纯化的MART1 蛋白和B16-F1 细胞裂解液。上述样品经SDS-PAGE 分离后电转至PVDF 膜，膜用5%脱脂牛奶封闭后，先后与本实验自制的兔抗血清（1∶3000 稀释）和HRP 标记的羊抗兔IgG（1∶5000 稀释）共孵育，ECL显影指示目标蛋白。

1.7 制备抗体用于免疫荧光染色

将B16-F1 细胞接种于事先放置有盖玻片的6孔板中制备细胞爬片，培养24 h 后用40 g/L 多聚甲醛于4℃固定15 min，经5 mL/L TxitonX-100 透化处理15 min，10 mL/L山羊血清37℃封闭30 min，然后分别与本实验制备的MART1抗血清（1∶500稀释）和阴性对照（1×PBS 取代一抗）37℃共孵育2 h，加入罗丹明标记的羊抗兔IgG（1∶100 稀释），37℃避光孵育30 min，荧光倒置显微镜下观测并记录结果。

2 结果

2.1 鼠MART1 编码cDNA 的克隆与原核表达载体构建

如1.2所述方法构建重组质粒pET32a-MART1，重组质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，获得的限制性片段长度与理论预期一致（图1），DNA 测序证实pET32a-MART1 中插入的DNA 序列、方向及读框之间的对接均无误。

2.2 MART1重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定

将重组质粒pET32a-MART1转化大肠杆菌Rosseta（DE3）感受态细胞并用IPTG 诱导5 h 后，SDSPAGE 分析显示诱导后的细菌中有一新生蛋白条带出现，其分子大小与MART1重组蛋白预期相对分子质量一致（图2）。该蛋白可经Ni-NTA 树脂亲和层析及切胶回收方法有效纯化。Western 印迹分析证实该融合蛋白能与His标签抗体特异性结合（图3）。

2.3 抗MART1抗体的制备及效价鉴定

用上述实验纯化所得重组MART1 蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔，经3 次皮下注射后，获取免疫后的兔血清并用ELISA 法分析制备抗体的滴度和特异性。

用上述纯化的同一批次的MART1 蛋白包被ELISA 检测板，将抗体梯度稀释（每个稀释度设3 个复孔）后进行抗原-抗体结合反应，以高出对照血清D450nm值2.1 倍的制备血清抗体的最高稀释度为抗体滴度。结果如图4，本实验所制备抗体的滴度为1∶1 024 000。

2.4 Western印迹鉴定制备抗体的特异性

Western 印迹结果显示，制备的抗体能有效识别和结合原核表达的MART1 蛋白，在相对分子质量23×103处出现明显的特异性反应条带，其分子大小与预期一致（图5）。另外，用16-F1细胞裂解液作为样品进行的分析也能检测出特异性条带，表明本实验制备的抗体能与真核细胞表达的MART1 抗原特异性结合（图5）。

图1 pET32a-MART1质粒的酶切鉴定

图2 SDS-PAGE分析原核表达及纯化的重组MART1

图3 Western印迹分析原核表达和纯化的MART1重组蛋白

同时，还用免疫荧光染色法检测了制备抗体的特异性。制备B16-F1细胞爬片后，先后与制备抗体（一抗）和罗丹明标记的羊抗兔IgG（二抗）共孵育，然后在荧光显微镜下分析结果。结果显示，制备抗体可以有效识别B16-F1细胞中的MART1蛋白（图6）。

3 讨论

为获得大量可用作免疫抗原的小鼠MART1 蛋白，我们利用基因克隆技术将小鼠MART1基因全长编码序列克隆到pET32a载体中，DNA 双向测序证实构建的pET32a-MART1 重组质粒中外源DNA 片段插入方向及其与质粒中6×His 标签编码序列框架对接无误，无移码突变、碱基缺失等。在大肠杆菌原核表达系统中，IPTG 能高效诱导MART1 重组蛋白表达。由于重组蛋白N 端带有6×His 标签，我们用Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化MART1 重组蛋白。为得到更高纯度的MART1 重组蛋白，我们将Ni-NTA 树脂纯化所得的蛋白样品用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化。

图4 ELISA检测抗体效价

图5 Western印迹检测抗体的特异性

图6 细胞免疫荧光分析制备抗体的特异性（×400）

为获得抗MART1的多克隆抗体，我们利用上述纯化的MART1 重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔，经1 次启动免疫和2 次强化免疫后，在实验动物体内获得高效价的抗MART1 多克隆抗体。经免疫印迹和细胞免疫荧光法分析证实，该抗体能有效识别和结合原核及真核细胞中表达的MART1蛋白，具有良好的特异性。

综上所述，我们建立了小鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术，制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。

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