刘建密, 纪翠红, 陈细红, 林积秀, 黄培枝,严叔平, 陈文乐, 陈彩霞, 张宇翔, 牟海青

(1. 福建三明市植保植检站, 三明 365000; 2. 福建永安市植保植检站, 永安 366000;3. 福建厦门出入境检验检疫局, 厦门 361012; 4. 中国检验检疫科学研究院, 北京 100029)



福建永安市辣椒丛枝病植原体的分子检测及鉴定

刘建密1, 纪翠红2, 陈细红3, 林积秀2, 黄培枝2,严叔平1, 陈文乐1, 陈彩霞1, 张宇翔2, 牟海青4*

(1. 福建三明市植保植检站, 三明 365000; 2. 福建永安市植保植检站, 永安 366000;3. 福建厦门出入境检验检疫局, 厦门 361012; 4. 中国检验检疫科学研究院, 北京 100029)

永安地区发病辣椒植株表现小叶、黄化、丛枝、簇芽等症状。利用植原体16S rDNA基因的通用引物R16 mF2/R16 mR2和R16F2n/R16R2,对发病辣椒植株总DNA进行巢式PCR检测,获得约1.2 kb的特异性DNA片段。经测序并在GenBank数据库进行比对分析,共获得4条植原体特定的16S rDNA基因序列(CHY-C4-1、CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1)。将测得的4条序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的4条植原体序列均聚类到16SrI组,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体聚类到同一支,而CHY-C4-1与已报道的16SrI组内的6个亚组均未聚类到一支,因此建议将CHY-C4-1命名为新的亚组。利用iPhyClassifier 在线分析软件对获得的4条植原体序列进行虚拟RFLP分析,结果与进化树获得的结果一致。

辣椒; 植原体; 16S rDNA; 巢式-PCR; 系统进化分析

植原体(phytoplasma)(原称类菌原体mycoplasma-like organism, MLO)为单细胞原核生物,无细胞壁,由生物膜包围,定殖于植物韧皮部筛管细胞[1],主要靠吸食植物韧皮部汁液的昆虫介体传播,如叶蝉、茶翅蝽、飞虱、蚜虫等[2]。自20世纪60年代以来,全世界范围内的1 000余种植物病害均被发现与植原体的侵染有关,其引起的症状主要包括丛枝、黄化、小叶、花变叶、花器退化等,严重时引起植株提早衰老,直至整个植株枯死[3]。我国也报道了100余种与之相关的植物病害[4]。

由于植原体无法人工培养[5],不能像其他原核生物一样进行系统的分类鉴定,单依靠发病植物症状、寄主或传播媒介往往不能精确地分类,比如同一植原体在不同寄主上的症状表现可能不同,不同植原体可能由同一介体昆虫传播,或引起的病害在症状表现上相同[6-9]。最初,植原体检测主要依靠电子显微镜以及借助于组织化学的方法。近年来,随着分子生物学技术的发展,核酸杂交和PCR等技术的广泛应用大大促进了植原体的分类鉴定[10]。特别是植原体16S rDNA PCR产物的RFLP分析,可以作为区分和鉴定植原体的一种简便、可靠、实用的方法,有助于揭示植原体之间的同源性和系统发育关系及遗传相关性[4]。值得一提的是,随着DNA测序技术和生物信息学技术的发展,2008年,Wei等利用计算机程序分析植原体16S rDNA的RFLP图谱,将所有的植原体划分为28个16Sr组和100个亚组[11-12]。根据NCBI分类数据库(Taxonomy)统计结果,目前已报道的16Sr植原体组增加到32个。

辣椒(CapsicumannuumL.)广泛分布于世界各地,是重要的蔬菜之一,在我国各地普遍栽培。辣椒上的植原体病害在亚洲、美洲和欧洲均有报道,并造成严重危害[13-16]。目前,国内有关辣椒植原体病害的报道较少,对其尚缺乏了解,加上植原体病害的症状与病毒病的症状相似往往被误认为是病毒病,因此单从症状上难以准确诊断,这为病害的防治带来困难。笔者对永安市辣椒田进行调查,采集的50株样本中发现有30株含有植原体,发病率达5%～30%[17],严重威胁着辣椒种植业。基于此,本文对永安辣椒发病株进行植原体16S rDNA 巢式PCR扩增和序列测定,获取其分子生物学信息,确定其分类地位和系统发育关系,为辣椒植原体病害的早期诊断,准确和快速检测,以及防控措施的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2013年07月11日和2013年07月12日在永安辣椒田采集表现为小叶、丛枝、黄化等症状的辣椒植原体病害疑似株及健康株样品,保存于4 ℃冰箱中。试验所需引物由Invitrogen生物公司合成,其他试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 辣椒叶片总DNA提取

采用植物基因组提取试剂盒提取辣椒叶片总DNA,置于-20 ℃冰箱中保存,备用。

1.3 16S rDNA的PCR扩增

1.3.1 引物

采用植原体16S rDNA的通用引物对[18-19]。

R16 mF2/R16 mR2为外侧引物对,R16 mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′,R16 mR2：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′。

R16F2n/R16R2为内侧引物对, R16F2n：5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′,R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′。

1.3.2 直接PCR(Direct-PCR)扩增

以供试样品总DNA为模板,R16 mF2/R16 mR2为扩增引物。反应体系(25 μL)：DNA 模板1.0 μL,引物(10 μmol/L)各1.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.0 μL,10×PCR buffer(MgCl2,2.5 mmol/L)2.5 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,ddH2O 18 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性50 s,55 ℃复性50 s,72 ℃延伸2 min,35个循环;72 ℃延伸7 min。

1.3.3 巢式PCR(Nested-PCR)扩增

把1.3.2中扩增的产物作模板,以R16F2n/R16R2为引物进行巢式PCR扩增,PCR反应体系及条件同1.3.2。

1.3.4 PCR产物电泳分析

取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,使用凝胶成像系统观察并摄影记录。

1.4 核苷酸序列测定与分析

将含有目的片段的Nested-PCR产物进行序列测定,由Invitrogen生物公司完成。将测得的16Sr DNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST分析,利用MEGA5与已报道的序列进行同源性比对,构建系统进化树。

1.5 植原体16S rDNA序列iPhyClassifier在线分析

利用植原体分类鉴定在线工具iPhyClassifier(http：∥plantpathology.ba.ars.usda.gov∕cgi-bin∕resource∕iphyclassifier.cgi)将测得16S rDNA序列(R16F2n/R16R2)进行虚拟酶切,并进行基于相似系数分析的16Sr组/亚组的确定(16Sr group/subgroup classification based on similarity coefficient)。

2 结果与分析

2.1 感病植株症状表现

如图1所示,辣椒植原体病害的症状表现为小叶,黄化,丛枝。早期发病的植株矮小,小叶,叶色发黄,不结果或结果很少;中后期发病的植株矮化或矮化不明显,中下部叶片正常,中上部叶片狭窄皱缩,叶柄变长,发病严重的植株黄化,叶片提早掉落,偶见有黄化斑驳症状。

图1 辣椒植原体病害外观特征Fig.1 Symptoms of pepper plants infected with phytoplasmas

2.2 PCR 检测

在永安市辣椒种植田取感病植株7株，分别以感病以及健康辣椒植株总DNA为模板,经R16 mF2/R16 mR2以及R16F2n/R16R2引物进行巢式PCR扩增,其中从4株发病样品中获得较亮的DNA片段,约1.2 kb,而健康植株和双蒸水对照均未扩增出特异条带。因此,推测发病辣椒植株中含有植原体病原,将该植原体暂定为辣椒丛枝植原体(pepper witches’-broom phytoplasma),该病害命名为辣椒丛枝病。

2.3 16S rDNA序列获得以及虚拟RFLP分析

将巢式PCR扩增产物进行克隆测序,共获得4条植原体序列,分别命名为CHY-C4-1(GenBank accession: KJ140783)、CHY-Y1-1(GenBank accession: KJ140784)、CHY-Y7-1(GenBank accession: KJ140785)、CHY-G1-1(GenBank accession: KJ140786)。通过在线分析软件iPhyClassifier,将获得的4条植原体序列进行虚拟RFLP分析,结果显示CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体(GenBank accession: NC_005303)相似度分别是0.98、1、0.98,因此应该归属于16SrI-B亚组;而CHY-C4-1序列与16SrI-B亚组植原体(GenBank accession: NC_005303)相似度最低,为0.97,根据Wei等[11]对植原体亚组划分的规定,建议将CHY-C4-1植原体命名为新的亚组。

2.4 16S rDNA序列系统进化树构建及分析

将本研究获得的4条植原体DNA序列与GenBank中已登录的25条不同组的植原体16S rDNA 序列进行分析并构建进化树(图2)，结果表明，从发病辣椒中获得的4条植原体16S rDNA 序列均属于植原体16SrI组,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体洋葱黄化植原体OY-M(NC_005303)以及翠菊黄化植原体(HQ646367)聚类到同一支,而CHY-C4-1与已报道的16SrI组内的6个亚组均未聚类到一支,形成一个独立的分支。因此,根据构建进化树分析获得的结果与虚拟RFLP分析获得的结果一致。

3 讨论

迄今,国内关于辣椒植原体病害的记载很少,只有仵光俊等运用传统方法研究发现辣椒丛枝小叶病的病原为植原体[20]。经比较,永安辣椒丛枝病与辣椒丛枝小叶病的症状相似,均有丛枝(簇芽)小叶的症状,病害均由植原体造成。本研究运用分子检测鉴定的方法,对永安地区辣椒丛枝病病原进行了检测鉴定。表明,该地区发病辣椒植株中含有16SrI组植原体,且其中3个株系属于16SrI组的B亚组,一个株系应该归属16SrI组中的新亚组。

不同国家引起辣椒植原体病害的发病症状以及病原种类不同。西班牙辣椒僵顶病是植原体16SrⅥ组,症状表现为节间缩短,花芽变绿变大,萼片发育不完全,果实少[16];印度尼西亚红辣椒上是植原体16SrⅡ组,症状多表现为叶片斑驳,小叶聚生[13];玻利维亚甜椒上是植原体16SrⅢ组,发病植株叶片变小,节间缩短[14];古巴甜椒上是植原体16SrⅠ组,常引起叶片黄化,节间缩短[15]。通过分子检测方法,本研究对永安市辣椒丛枝病害的病原进行了检测与鉴定,共发现4个植原体株系,其中3个株系属于16SrI组的B亚组,一个株系属于16SrI组中新的亚组,为该病害的预防与控制奠定了基础。此外,发病辣椒植株中是否存在植原体复合侵染的情况,或是与其他病原菌的复合侵染情况,均有待于进一步的研究进行论证。

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(责任编辑：杨明丽)

Molecular detection and identification of the phytoplasma associated with pepper witches’ broom in Yong’an

Liu Jianmi1, Ji Cuihong2, Chen Xihong3, Lin Jixiu2, Huang Peizhi2, Yan Shuping1, Chen Wenle1, Chen Caixia1, Zhang Yuxiang2, Mou Haiqing4

(1. Sanming Plant Protection and Quarantine Station, Fujian 365000, China; 2. Yongan Plant Protection and Quarantine Station, Fujian 366000, China; 3.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Fujian 361012, China; 4. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

Symptoms of little leaf, leaf yellowing, witches’ broom and bunching of small leaves were observed in pepper fields in Yong’an City. By use of nested-PCR, the 16S rRNA gene of phytoplasma associated with infected pepper was amplified with universal primer pairs R16 mF2/R16 mR2 and R16F2n/R16R2. The specific DNA fragments of ca. 1.2 kb were obtained from the total DNA of diseased samples. After nucleotide sequencing and BLAST analysis in GenBank, four sequences of phytoplasma 16S rRNA gene (CHY-C4-1, CHY-Y1-1, CHY-Y7-1 and CHY-G1-1) were obtained. The similarity and phylogenetic analysis showed that the four sequences were closely related to 16SrI group of phytoplasma. In the phylogenetic trees constructed with 16S rDNA, CHY-Y1-1, CHY-Y7-1 and CHY-G1-1 were clustered together with subgroup B of aster yellows group (16SrI-B), and it was suggested that CHY-C4-1 should belong to a new subgroup because CHY-C4-1 was not clustered together with any other subgroups of 16SrI. The results of four 16S rDNA sequences were analyzed by virtual RFLP online usingiPhyClassifier software, and the result was correspondent with phylogenetic tree.

pepper; phytoplasma; 16S rDNA; nested-PCR; phylogenetic analysis

2014-03-13

2014-04-17

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.022

* 通信作者 E-mail: mouhaiqing@163.com