杨 楠, 周 威, 王 光, 丁 寅, 金 岩*

(1. 解放军第309医院口腔科, 北京 100091; 2. 解放军91551部队门诊部, 江西 九江 332005；3. 军事口腔医学国家重点实验室, 陕西省口腔医学重点实验室,第四军医大学口腔医院: *正畸科, **组织工程中心, 陕西 西安 710032)

miR- 21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

杨 楠1, 周 威1, 王 光2, 丁 寅3*, 金 岩3**

(1. 解放军第309医院口腔科, 北京 100091; 2. 解放军91551部队门诊部, 江西 九江 332005；3. 军事口腔医学国家重点实验室, 陕西省口腔医学重点实验室,第四军医大学口腔医院:*正畸科,**组织工程中心, 陕西 西安 710032)

目的: 观察miR- 21在人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)成骨分化过程中的表达。方法：通过转染使hBMMSCs过表达或抑制miR- 21后，分别采用ALP染色、茜素红染色观察各组ALP活性和钙化结节的表达形成量；并采用Real time RT- PCR、Western blot检测各组成骨相关基因Runxz、osterixmRNA及其蛋白的表达水平，以观察miR- 21对hBMMSCs体外成骨分化的调控作用。将表达不同水平miR- 21的各组hBMMSCs与HA/TCP复合后植入裸鼠皮下，8周后取材，采用HE染色和Masson三色染色观测各组类骨质的形成量。结果: miR- 21在hBMMSCs成骨过程中表达量较对照组明显升高(P<0.05)。过表达miR- 21能促进hBMMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力；而抑制miR- 21则能降低hBMMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力。结论：miR- 21可外调控hBMMSCs成骨分化，在骨形成过程发挥作用。

miR- 21; 骨髓间充质干细胞(hBMMSCs); 成骨分化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):465]

miRNA是近年来发现的一类具有18～25个核苷酸的非编码RNA，可通过与靶基因3′UTR区非完全配对来抑制靶基因的翻译和稳定。有研究发现，miRNA对不同细胞的成骨分化均具有调控作用[1-3]。但如何挑选在骨髓间充质干细胞成骨分化中起关键作用的miRNAs，这些miRNAs在调控骨髓间充质干细胞体外、体内成骨分化中的作用如何，以及其具有哪些作用机理等，目前还未得到充分的研究。本课题组在前期研究中，利用基因芯片的方法筛查了人组织特异性骨髓间充质干细胞 (hBMMSCs) 成骨分化过程中差异性表达的miRNAs，并通过生物信息学技术对筛选的差异性miRNAs与hBMMSCs成骨分化的miRNA基因芯片结果进行了比较，发现miR- 21在hPDLSCs和hBMMSCs成骨分化过程中均有差异性表达。我们认为， miR- 21在间充质干细胞成骨分化中起到了重要作用，但其如何调控hBMMSCs成骨分化目前尚不清楚，亦未见相关研究报道。

1 材料和方法

1.1 实验材料和动物

Percoll分离液(GE Healthcare，美国)；MicroRNA检测试剂盒(广州锐博)；pre- miR- 21、anti- miR- 21、Cy3 labeled miR pre- negative control、 Cy3 labeled miR anti- negative control、siPORT NeoFX转染试剂(Ambion，美国)；羟基磷灰石粉末(HA- TCP)(Zimmer Scandinavia，丹麦)；十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma，美国)；8周龄无肥胖无糖尿病联合免疫缺陷鼠(NOD/SCID)(第四军医大学实验动物中心)，体质量(22～35)g，分笼饲养于实验动物中心万级净化饲养间。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的培养及鉴定

1.2.1.1 hBMMSCs的分离和培养

经伦理委员会批准和患者知情同意后，选取5例需行髂骨移植术和开放性骨折手术的患者(排除其他全身性疾病和骨质疏松)，分别在术中抽取其骨髓5 mL置于含有枸橼酸锂的抗凝管中。在超净台内将骨髓与等体积不含血清的低糖α- MEM培养液(含青霉素钠100 U/mL、链霉素100 U/mL)混合，用吸管反复吹打使骨髓组织均匀分散后，室温下400 g离心10 min；去掉脂肪层，并用低糖α- MEM 培养液重悬细胞后，将其缓慢注入预先加入等体积1.073 g/mL Percoll分离液的离心管内，注意保持液体分界面完整(Percoll分离液位于下方，而稀释血液位于上方)；再次400 g离心 30 min，吸取中间的单核细胞层，用PBS洗涤2次后重悬于含100 mL/L胎牛血清和100 U/mL青、链霉素的低糖α- MEM培养液中；调整细胞浓度为1×106/L后将其接种于25 cm2的培养瓶中，并置于CO2孵箱中。常规条件下培养24 h后，首次换液并去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，并用倒置显微镜观察细胞形态和生长情况。待细胞生长至80%～90% 融合时，用 2.5 g/L胰蛋白酶消化，并按1 ∶2的比例进行传代培养。取对数生长期第3代细胞用于实验。

1.2.1.2 hBMMSCs的鉴定

取对数生长期第3代hBMMSCs，用2.5 g/L胰酶消化后制备细胞密度为1×106/mL的单细胞悬液，并将其分别加入8个1.5 mL的EP管中(每管100 μL)；然后分别在各管中加入CD29、CD90、CD14、CD34、CD- 146、CD44 、CD45和STRO- 1 抗体，室温孵育1 h。孵育结束后，将细胞重悬于预冷的PBS中，并用流式细胞仪分别检测细胞各表面分子的表达水平。

1.2.2 Real time RT- PCR检测miR- 21在hBMMSCs成骨分化中的表达

取对数生长期第3代hBMMSCs接种于成骨诱导液(含10-8mol/L地塞米松、50 μmol/L 维生素C、10 mmol/L β- 甘油磷酸钠、100 mL/L胎牛血清的α- MEM培养液)中常规条件下进行成骨诱导培养。分别于诱导培养0、1、3、7、10、14、21、28 d各时间点取一组细胞，按Trizol RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA；并利用miRNAs抽提试剂盒反转录合成cDNA。然后以cDNA为模板，并按照real time RT- PCR试剂操作说明加入检测体系，用ABI7500实时定量仪(ABI，德国)检测miR- 21在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的表达。所用引物由广州锐博生物有限公司合成。

1.2.3 miR- 21对hBMMSCs体外成骨分化影响的观察

1.2.3.1 miR- 21的转染和成骨诱导

取对数生长期第3代hBMMSCs，用新鲜α- MEM培养液常规条件下培养24 h以确保细胞的生长活力。转染时，用2.5 g/L胰酶消化细胞，并将其接种于6孔培养板(每孔接种2×105个)，然后用siPORT NeoFX转染试剂分别转染pre- miR- 21、pre- miR negative control、anti- miR- 21、anti- miR negative control。转染2 d后换用成骨分化诱导培养基(100 mL/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 μmol/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的α- MEM)进行成骨诱导培养。1.2.3.2 miR- 21转染后hBMMSCs成骨能力的检测

分别于诱导培养7、21 d时，取转染pre- miR- 21、 pre- miR negative control、 anti- miR-21、anti- miR negative control 的各组分化细胞，分别进行碱性磷酸酯酶(ALP)染色和茜素红染色。其中诱导培养7 d的各组细胞按ALP染色试剂盒说明进行ALP活性定量检测。诱导培养21 d的各组细胞用40 g/L多聚甲醛液固定20 min后，加入40 mmol/L 茜素红染色10 min，相差显微镜下观察并拍照；再次染色后，在6孔板内加入100 mmol/L的氯化十六烷基吡啶溶液，充分溶解后，用分光光度仪计测各孔的吸光度值并进行定量分析。

1.2.3.3 成骨相关基因的检测

转染pre- miR- 21、pre- miR negative control、 anti- miR- 21、 anti- miR negative control后的各组细胞于成骨诱导7 d后, 分别按照Trizol RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA；用分光光度仪测量各样品中的RNA含量后，按照反转录试剂盒的操作说明，将RNA反转录为cDNA。然后以cDNA为模板按照real time RT- PCR试剂操作说明书加入检测体系，用ABI7500实时定量仪(ABI，德国)检测各组各成骨相关基因Runx2、OsterixmRNA的表达水平。所用引物由上海生工生物有限公司合成，具体序列见表1。

表1 Real time RT- PCR所用的引物序列

1.2.3.4 Western blot检测成骨相关基因的蛋白表达

转染pre- miR- 21、 pre- miR negative control、 anti- miR- 21、 anti- miR negative control后的各组细胞于成骨诱导7 d后, 分别用2.5 g/L胰蛋白酶进行消化，并离心收集细胞于1.5 mL的 EP管中；然后加入蛋白裂解液制备蛋白样本。用Bradford法测定各样品中的蛋白含量后，按照所测目的基因蛋白的大小，选择不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳。电泳完成后，利用电场作用将凝胶中的蛋白质分子转移到PVDF 膜上，并利用抗原、抗体特异结合作用使结合于膜上的目的基因蛋白被Runx2、Osterix(一抗、二抗)特异性标记(二抗上标记的辣根过氧化酶可催化底物使之发光)；用X线片将光信号转化成肉眼所见的条带后，Image J软件分析各条带的灰度值，并计算各目的基因蛋白的相对含量。

1.2.4 miR- 21转染后hBMMSCs的体内异位成骨分析

1.2.4.1 hBMMSCs复合HA/TCP植入体内的过程

取第3代hBMMSCs分别转染pre- miR- 21、pre-miR- 21 negative control、anti-miR-21、anti-miR- 21 negative control，并将转染后的hBMMSCs与羟基磷灰石粉末(HA/TCP)复合后植入免疫缺陷鼠皮下。具体方法如下：首先取40 mg羟基磷灰石粉末，用100 μL基础培养液湿润后吸入1 mL注射器中；然后取上述转染后的各组hBMMSCs，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后重悬于200 μL α- MEM培养液中，并制成细胞密度为4×106的细胞悬液，将其小心加入1 mL注射器中湿润的HA/TCP团块上面，置于CO2孵箱中孵育过夜(每组细胞各制备4个样本)。取8周龄免疫缺陷鼠，用10 g/L戊巴比妥腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉后，碘伏消毒术区，并在其一侧皮肤做10～12 mm长的切口，同时将注射器插入皮下使之形成一个约 3 mm 的皮下袋。然后取装有移植物(HA/TCP复合不同组细胞)的注射器, 去除一部分HA/TCP 上层培养液后，将其插入预先形成的皮下袋中并注入移植物；缓慢拔出注射器后，严密缝合伤口。同时在对侧再植入另外一个移植物。

1.2.4.2 异位成骨分化过程的组织学分析

移植物植入8周后取材，置于多聚甲醛液中4 ℃下固定2 d后，100 g/L EDTA(pH=7.0)脱钙1周；流水冲洗2 h后石蜡包埋、切片、常规HE染色和Massons三色染色，光学显微镜观察并拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，两组间比较采用t检验或秩和检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 体外培养的hBMMSCs表型鉴定结果

流式细胞仪检测结果显示，采用Percoll分离并结合贴壁法培养的hBMMSCs过表达间充质干细胞表面标志物STRO- 1和CD- 146， 同时也表达间充质标志物CD29、CD90、CD44；不表达造血干细胞标志物CD14、CD34和CD45(图1)。

图1 hBMMSCs表面分子鉴定结果

2.2 miR- 21在hBMMSCs成骨分化过程中的表达

第3代hBMMSCs经成骨诱导0、1、3、7、10、14、21、28 d后，real time RT- PCR 检测结果显示，miR- 21在hBMMSCs中的表达水平随着诱导培养时间的延长而逐渐升高，诱导培养第10天时表达水平最高， 此后逐渐下降; 各时间点的miR- 21表达量均明显高于对照组(P<0.05)(图2)。

2.3 miR- 21转染后其转染效率的检测

将pre- miR- 21、pre- miR negative control、 anti-miR- 21、 anti- miR negative control分别转染hBMMSCs，并于转染后2、7 d利用real time RT-PCR 检测其转染效率。结果显示：pre- miR- 21转染2 d后，miR- 21的表达量较对照组上升了554倍，7 d后的表达量为对照组的133倍 (图3a)；而anti- miR- 21转染2 d后，miR- 21表达量则下降了90%，7 d后下降82% (图3b)。同时Cy3 标记的pre- miR和anti- miR作为阴性对照，在荧光显微镜下观测转染阳性细胞数发现，miR- 21转染效率达到了98%以上。

图2 miR- 21在 hBMMSC 成骨分化过程中的表达

a.转染pre-miR-21后 b.转染anti-miR-21后

图3 转染后miR- 21的表达(*与对照组相比P<0.05)

2.4 miR- 21体外调控hBMMSCs成骨分化的观察结果

化学合成miR- 21前体(pre- miR- 21)和抑制剂(anti- miR- 21)分别转染hBMMSCs后，经检测发现前者过表达miR- 21，后者抑制miR- 21的表达，同时观察miR- 21表达水平的变化对hBMMSC成骨分化的影响。转染2 d后的各组hBMMSCs经成骨分化诱导7 d后，ALP染色结果显示: 过表达miR- 21组的ALP染色较对照组增加，而抑制miR- 21组的ALP染色较对照组减弱 (图 4a)；过表达miR- 21后ALP活性上升了2倍，而抑制miR- 21后ALP活性降低了52%(P<0.05)(图4b)。成骨诱导21 d茜素红染色结果显示：与对照组相比，过表达miR- 21组的矿化结节增加，而抑制miR- 21组的矿化结节明显减少(P<0.05)(图4c)。成骨诱导后，分别检测各组hBMMSCs的成骨特异性基因Runx2、Osterix mRNA和蛋白的表达水平结果显示: 过表达miR- 21组的Runx2和Osterix的表达水平分别上升了1.7倍和2.2倍，而抑制miR- 21组的Runx2和Osterix基因的表达水平分别下降了42%和58%(P<0.05)(图4d、e)；Runx2和Osterix蛋白在过表达miR- 21组的表达水平也显著高于对照组(P<0.05)，而抑制miR- 21组的Runx2和Osterix蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)(图4f)。

2.5 miR- 21体内调控hBMMSCs成骨分化的观察结果

为进一步验证miR- 21在体内是否能够促进异位骨的形成，分别将pre- miR- 21、anti- miR-21、pre- miR negative control和anti- miR negative control转染hBMMSCs；将转染48 h后的各组细胞与HA/TCP支架材料复合并植入8周龄免疫缺陷鼠的皮下。8周后取材，HE染色和Masson三色染色观察结果显示：过表达miR- 21组的类骨质形成量明显多于对照组；而抑制miR- 21组的类骨质形成量明显少于对照组(P<0.05)(图5～6)。该结果显示，过表达miR- 21能够增强hBMMSCs的体内成骨分化能力。

a. ALP及茜素红染色; b. ALP活性定量结果; c. 钙化结节定量结果; d、e. Runx2、Osterix mRNA表达水平比较;

f. Runx2、Osterix 蛋白表达水平比较; 1为pre-miR-cont; 2为pre-miR-21; 3为anti-miR-cont; 4为anti-miR-21

图4 miR- 21对hBMMSCs体外成骨分化能力的影响(相同符号之间相比P<0.05)

图5 HE、Masson's三色染色观察类骨质形成情况(HA为羟基磷灰石; B为bone)

1为pre-miR-cont; 2为pre-miR-21;

3 讨论

hBMMSCs成骨分化是一个复杂的过程，受多条信号通路在转录水平和转录后水平的调控。近年来研究发现，miRNAs能调控多种细胞的成骨分化；其中miR-204/211可通过抑制其靶基因Runx2的表达，从而促进间充质干细胞 (MSCs) 的成骨分化，并抑制其成脂分化[4]。有文献报道，Runx2能够负向调控miR簇23a～27a～24-2的表达，从而增强成骨标志基因的表达和成骨分化[5]。Luzi等[6]发现，在人脂肪组织来源的MSCs中，miR- 26能通过抑制Smad1的翻译负向调控成骨分化，而过表达miR- 196则能够抑制HOXC8，促进成骨分化，并抑制脂肪间充质干细胞的增殖；mir- 125b 能够抑制小鼠间充质细胞系ST2的成骨分化，而miR- 133、miR- 135能够分别作用于Runx2和Smad5从而抑制C2C12细胞系的成骨分化。以上研究结果表明，miRNAs在调控干细胞成骨分化中起到了重要的作用。

本研究利用生物信息学技术检索了目前报道的hBMMSCs成骨分化的miRNA 基因芯片结果，结合本课题组前期研究的牙周膜干细胞成骨芯片结果，我们发现miR- 21在hBMMSCs成骨分化中表达量升高。因此，我们认为miR- 21可能是调控间充质成骨分化的关键miRNA之一。本实验中通过对miR- 21在hBMMSCs成骨过程中表达谱的分析发现，miR- 21的表达量在成骨过程中的各时间点均较对照组明显升高，这一结果与基因芯片结果一致。对miR- 21体外调控hBMMSCs成骨分化的功能进行研究发现，上调miR- 21能够促进hBMMSCs的成骨分化，而下调miR- 21则抑制hBMMSCs的成骨分化。为了进一步验证miR- 21对hBMMSCs体内成骨分化的影响，我们将表达不同水平miR- 21 的hBMMSCs与HA/TCP复合后植入裸鼠皮下，并观察各组类骨质的形成情况。结果显示，上调miR- 21组的类骨质形成量明显多于对照组，而miR- 21抑制组的类骨质的形成量则明显少于对照组。Eskildsen等(2011)利用基因芯片的方法筛选出了hBMMSCs成骨分化中下调的miR- 138，通过对miR- 138体外与体内成骨功能的研究发现，miR- 138能抑制hBMMSCs在体内和体外的成骨分化，并发现hBMMSCs在向其他中胚层组织分化中也出现miR- 21的表达下调；由此作者推测miR- 138可能与干细胞分化状态的维持有关[7]。但本实验中则发现，miR- 21对干细胞成骨分化的作用则与miR- 138相反。另有文献报道，miR- 21在人脂肪来源的间充质干细胞成脂分化中表达上调，说明miR- 21能够促进人脂肪来源的MSCs成脂分化[8-9]。以上结果均提示，miR- 21在干细胞分化过程中起到了重要作用。

miR- 21是一个具有多种功能的miRNAs， 并在多种生理病理过程中发挥着重要的作用。有研究表明，miR- 21几乎在所有实体肿瘤中都过表达，并且能促进肿瘤细胞的增殖和迁移，因此miR- 21在肿瘤中得到了广泛的研究[10-12]。另有研究发现，miR- 21对心肌成纤维细胞也具有调控作用，并参与心血管疾病的发生[13]。虽然miR- 21也在多种正常组织中表达，但是对于它在生理状况下的功能还研究甚少。Raymond Ng等[14](2012)发现，miR- 21能够促小鼠肝脏的再生。本实验中也发现，miR- 21在BMMSCs中过表达，并能促进hBMMSCs的成骨分化。但miR- 21是通过哪些靶基因来调控hBMMSCs成骨分化的，还需进一步深入的研究。

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MiR- 21 regulates osteogenesis of human marrow- derived mesenchymal stem cells

YANG Nan*, ZHOU Wei, WANG Guang, DING Yin, JIN Yan

(*DepartmentofStomatology,The309HospitalofPLA,Beijing100091,China)

AIM: To investigate the expression and the role of miR- 21 in osteogenesis of human marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMMSCs). METHODS: The expression level of miR- 21 after transfection of synthetic per-miR-21 was confirmed by real time RT- PCR. After 2 days of transfection, hBMMSCs were induced to osteoblast differentiation. ALP and Alizarin red S staining were used to determine osteogenic ability. Real time RT- PCR and western blot were used to analyze the estrogenic marker gene expression. hBMMSCs transfected with pre- miR- 21, anti- miR- 21 or miR control were loaded on hydroxyapatite- tricalcium phosphate scaffold and implanted s.c. in NOD/SCID mice. 8 weeks after transplantation HE staining and Masson's trichrome staining were used to observe the new bone formation. RESULTS: miR- 21 was increased during osteogenic differentiation of hBMMSCs. Gain- loss- functional analysis showed that up- regulation of miR- 21 promoted osteogenic differentiation of hBMMSCs in vitro and in vivo. On the contrary, silencing of miR- 21 inhibited the osteogenic differentiation of hBMMSCs in vitro and in vivo. CONCLUSION：miR- 21 can promote osteogenic differentiation of hBMMSCs in vitro and enhance ectopic bone formation in vivo.

miR- 21; human bone marrow- derived mesenchymal stem cells (hBMMSC); osteogenic differentiation

2014-05-25;

2015-01-07

国家自然科学基金(81020108019)

杨 楠(1982-)，女，满族，北京人。 博士，主治医师

丁 寅, E-mail: Dingying@fmmu.edu.cn

金 岩, E-mail: yanjin@fmmu.edu.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0465-07