董 瑶, 徐 燕, 马 倩, 孟明理, 沈继龙, 徐振山, 宋礼华

(安徽 合肥 230032：1．安徽医科大学口腔医学院 安徽医科大学附属口腔医院牙周黏膜科 安徽省口腔疾病研究中心实验室；2.安徽安科生物工程(集团)股份有限公司；3.安徽医科大学人兽共患病安徽省重点实验室)

抗牙龈卟啉单胞菌卵黄抗体的制备、纯化和生物学特性鉴定

董 瑶1, 徐 燕1, 马 倩2, 孟明理1, 沈继龙3, 徐振山2, 宋礼华2

(安徽 合肥 230032：1．安徽医科大学口腔医学院 安徽医科大学附属口腔医院牙周黏膜科 安徽省口腔疾病研究中心实验室；2.安徽安科生物工程(集团)股份有限公司；3.安徽医科大学人兽共患病安徽省重点实验室)

目的: 制备特异性抗牙龈卟啉单胞菌(Pg)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)并检测其生物学特性。方法：厌氧培养牙龈卟啉单胞菌，将甲醛灭活的菌体经翅膀下浅层肌肉免疫150日龄罗曼母鸡3次，每次间隔10 d。取鸡蛋用两步硫酸铵沉淀法提取IgY，BCA法测定蛋白质含量，ELLSA法检测纯化后IgY的特异性和抗体效价变化，并进行SDS- PAGE和Western blotting分析。观察抗Pg- IgY对红细胞凝集的抑制作用。结果：经3次免疫后，抗体滴度最高可达25 600，纯化后每个鸡蛋可得约70 mg IgY抗体; SDS- PAGE分析，纯化的IgY有1条主要蛋白带，相对分子质量(Mr)为180 kD，纯度为65%; Western blotting分析, 该IgY抗体可识别抗原Pg。每孔3.125 μgPg- IgY可有效抑制Pg的红细胞凝集活性；1 mg/mLPg- IgY可有效抑制Pg生长。结论： 本研究得到的IgY特异性强，产量和纯度高。

牙龈卟啉单胞菌; 免疫球蛋白Y; 卵黄抗体

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):459]

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivals,Pg)是目前公认慢性牙周炎的主要致病菌，与牙周炎的发生发展密切相关[1]，85%的病变位点可检测到Pg的存在，而在健康的牙龈中几乎没有或者数量很少[2]。Pg拥有一系列的致病因子，如各种酶、内毒素、囊泡和纤毛等[3]。针对Pg的免疫治疗有可能对牙周炎的预防和治疗产生积极的影响。有研究发现，慢性牙周炎患者的血清和龈沟液中有Pg特异性抗体的存在[4]，然而抗体的产生只是表明Pg激活了宿主的免疫防御反应，但这些抗体并不足以清除Pg引起的感染[5]。在一项以食蟹猕猴为对象的动物实验中，通过肌肉或者皮下注射甲醛灭活的Pg可成功诱导出特异性血清抗体产生[6]，而且还能抑制动物丝线结扎法构建的实验型牙周炎过程中Pg的定植，但这些抗体并未起到完整的保护作用[7]。如何获得大量安全有效的抗体以用于牙周病的免疫治疗卵黄抗体以其安全、稳定的理化性质，容易获取等优越性引起了我们的关注。本实验用甲醛灭活的Pg免疫产蛋母鸡，以获得特异性抗Pg的卵黄抗体，并评价其免疫效果和抗体功能，进一步探索卵黄抗体的大规模制备工艺，以期为卵黄抗体在牙周病免疫治疗中的应用和推广提供思路和实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和设备

罗曼母鸡[8]60只(安徽医科大学动物实验中心提供，隔离饲养至150日龄供免疫用)；完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant, CFA)、不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)(Sigma，美国)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY(SC-2428, santa cruz，美国)；牙龈卟啉单胞菌(JCM12257)(国际标准菌株ATCC33277，日本微生物菌种保藏中心)；牛-脑心浸液培养基(brain heart infusion，BHI)CM917(北京陆桥技术)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物)；BCA检测试剂盒(北京原平皓生物); 考马斯亮蓝R-250、硝酸纤维素膜(NC膜，0.22 μm)(北京索莱宝生物科技)；预染蛋白Marker(Thermo Scientific, 美国)；酶标仪(ELX808U，Bio- Tek，美国)；正倒置显微镜(Nikon，日本)；厌氧培养箱(Don Whitley DG250 Anaerobic workstation，英国)；凝胶图像处理系统1600(GIS)(上海天能)。

1.2 抗原制备——牙龈卟啉单胞菌的厌氧培养

1.2.1 BHI羊血培养基制备

BHI液体培养基含BHI基础粉37 g，维生素K1 1 mg，氯化血红素5 mg，半胱氨酸0.5 g。BHI羊血固体培养基制备方法：在上述液体培养基配方基础上加入15 g/L琼脂和0.8 g/L冻干脱纤维冻融羊血(北京友康基业生物科技)混匀，平铺于无菌培养皿中；冷却至室温后4 ℃保存备用。

1.2.2Pg冻干粉复苏和培养

按照JCM说明进行操作。画线法接种于BHI羊血固体培养基，置于厌氧箱(混合气比例为100 mL/L CO2、100 mL/L H2、800 mL/L N2)中 37 ℃培养24～48 h，观察有无特征性黑色菌落生成，并进行革兰氏染色鉴定。将固体培养基上的单克隆菌落接种于BHI液体培养基上用以增菌，厌氧培养48 h, 离心(4 000 r/min, 10 min)开收集菌体。

1.2.3Pg灭活和抗原乳化

10 g/L甲醛灭活Pg菌体，4 ℃过夜，无菌PBS清洗3次，调制菌液浓度为1.0×109CFU /mL，取两个5 mL注射器并去掉针头，通过无菌塑料软管联通组装成抗原乳化装备，一注射器内为1 mL 灭活的P.gingivals菌液，另一注射器内为等量的弗氏佐剂，通过推拉注射器将两侧液体混合(注意保持直线，防止堵塞)，推拉时要保证速度又快又稳，连续推拉30 min，最终呈乳白色的油包水状注射剂，用于以下实验。

1.3 蛋鸡免疫

60只罗曼母鸡随机分为两组：空白对照组(20只)不免疫，实验组(40只)免疫Pg。经鸡翅膀下浅层肌肉多点注射上述已灭活的Pg菌液免疫母鸡，共免疫3次，每只鸡每次注射1 mL，首次免疫用CFA，后2次用IFA加强免疫，每次免疫间隔时间为10 d。初次免疫后即开始收集鸡蛋，标记后4 ℃保存。免疫前的鸡蛋同样保存作为空白对照。

1.4 IgY提取和纯化

1.4.1 改良水稀释法获得水溶性卵黄抗体溶液

清洁鸡蛋表面，卵黄分离器去除蛋白和卵黄膜，卵黄液与蒸馏水(1 ∶8)在4 ℃条件下稀释，搅拌均匀后逐滴加入0.1 mol/L HCl酸化，使卵黄最终稀释为1 ∶9; 调节pH值为5.0～5.2，4 ℃孵化12 h，离心(10 000 r/min, 20 min, 4 ℃)并收集上清，所收集上清液即水溶性IgY溶液(water - soluble-fraction, WSF)，-20 ℃保存备用。

1.4.2 硫酸铵沉淀法纯化IgY

向上述WSF中滴加饱和硫酸铵使硫酸铵最终浓度为400 g/L，充分搅拌均匀，同上法离心得沉淀，该沉淀再次用去离子水溶解, 即得一步硫铵法IgY; 再次重复上述硫酸铵沉淀法即得两步硫铵法IgY。溶液置于常规处理过的透析袋中，以蒸馏水透析24 h(4 ℃)，换水3次，以去除硫酸铵， 分装后-20 ℃保存。

1.5 IgY检测实验

1.5.1 蛋白含量的测定

用BCA法测定蛋白含量，将浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的标准品20 μL。分别加到96孔酶标板的标准品孔中，再取20 μL纯化IgY加到样品孔中。取5 mL BCA试剂(A液)和100 μL Ca2+试剂(B液)以50 ∶1的浓度配制成BCA工作液，每孔加入200 μL的BCA工作液，37 ℃ 反应30 min，在酶标仪上读取吸光度(A562)值，绘制标准曲线，计算样品的蛋白含量。

1.5.2 IgY分子鉴定

1.5.2.1 SDS- PAGE电泳

非还原型SDS- PAGE检测相对分子质量(Mr)，其浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为7.5%。还原型SDS- PAGE电泳观察IgY重链(Heavy chain)和轻链(Light chain)，其浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%，每孔的上样量为10 μg。

1.5.2.2 Western Bloting检测抗体特异性

将超声破碎的Pg溶液进行还原型SDS- PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)上，用50 g/L的脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，含0.05%(体积分数)Tween20的TBS(pH=7.4)液清洗3次×5 min，孵一抗(实验组一抗为免疫后的抗Pg- IgY，免疫前鸡蛋的IgY作为阴性对照，浓度均为20 μg/mL)4 ℃过夜；同上洗膜后孵育二抗，羊抗鸡HRP- IgY(1 ∶8 000)，DAB显色。

1.5.2.3 ELLSA检测IgY抗体滴度变化

用ELLSA方法检测不同免疫时间点卵黄抗体滴度的变化，并绘制滴度变化趋势图。96孔板包被超声破碎的Pg溶液，浓度调制为10 μg/mL，37 ℃保温箱中孵育2 h后，再加入10 g/L牛血清白蛋白(BSA)的非特异性抗原，37 ℃封闭2 h，用含0.05%(体积分数)Tween20的PBS液清洗 3次，拍干。逐孔加2倍稀释的IgY(从原液开始，1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8……1 ∶215共16个浓度组)100 μL，37 ℃温育2 h。洗涤后加入羊抗鸡HRP- IgY(产品原液稀释10 000)100 μL，37 ℃温育1 h；邻苯二胺(OPD)37 ℃显色15 min，50 μL 硫酸(2 mol/L)终止反应，在酶标仪上读取OD450值。以10 g/L BSA作阴性对照，PBS作空白对照。结果判断：测定孔值(S)/阴性对照孔OD450值(N)，结果大于2.1为阳性, 该孔对应样品的稀释倍数为IgY抗体的滴度。

1.5.2.4 评价IgY对Pg生长的抑制作用

取15 mL试管8个，随机分为4组(n=2)。Pg- IgY(从第3次免疫后10～30 d的鸡蛋提取)用BHI液体培养基分别重悬为4、2、1 mg/mL，未免疫鸡蛋的IgY(4 mg/mL)同样用BHI液体培养基重悬作为对照组。过滤除菌后，每管9 mL溶液，再向每个试管加入1 mL浓度为1×108CFU/mL的Pg菌液，厌氧培养箱内培养，每小时取样100 μL，每管取2个样本，4 ℃保存，连续取样24 h后，检测所有样本的OD600 nm并绘制细菌生长曲线。

1.5.2.5 抗Pg- IgY抑制红细胞凝集实验

血球凝集(HA)试验，取新鲜培养的Pg菌液率离心(10 000 r/min, 离心10 min)，PBS重悬，调整菌液浓度至1×109CFU/mL，记为n。在96孔“U”形微量反应板上第一孔加50 μL浓度为n的Pg菌悬液，依次用生理盐水倍比稀释至第8孔；第9孔为红细胞对照，所有孔均加入0.5%人红细胞悬液50 μL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。

血球凝集抑制(HI)试验，根据HA试验结果，确定Pg菌的血凝价，配制出4倍血凝单位菌悬液(1×108)。第1孔加待检测抗IgY 50 μL(1 μg/μL)，倍比稀释至第7孔；第8孔加入Pg对照。所有孔均加入50 μL 4个血凝单位的Pg菌液和50 μL 0.5%人红细胞悬液，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果。

1.6 统计学分析

采用SPASS 13.0软件对所得数据(means±SD)进行one- way ANOVA统计分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1Pg鉴定

Pg在BHI羊血琼脂板上形成特征性菌落，黑色，圆形，表面光滑。显微镜油镜下观察，革兰氏染色结果显示Pg为G-菌，红色，形态为球杆菌或短杆菌(图1)。

图1 Pg革兰氏染色结果(油镜，×1 000)

2.2 IgY蛋白含量的测定

BCA检测结果显示，每个鸡蛋的WSF溶液含有150 mg蛋白，经盐析、透析纯化后每个鸡蛋大约得到70 mg的总IgY。

2.3 电泳结果

非还原型SDS- PAGE结果显示，硫酸铵沉淀法纯化后的IgY与Thermo IgY提纯试剂盒提取的IgY有一致的主带，其分子量约为180 kD(图2)，符合理论值。还原型SDS- PAGE结果显示，β-巯基乙醇还原裂解后的IgY杂带较多，其中含有65 kD的重链和25 kD 轻链2条主带，与理论值一致(图3); 经GIS软件分析重链纯度，一步硫铵法纯化的IgY纯度为50%，两步硫铵法纯化的IgY纯度为65%。

2.4 Western Bloting检测Pg- IgY抗体特异性

Western Bloting检测结果发现，抗Pg- IgY能识别Pg的诸多片段，用GIS凝胶软件分析图像，发现抗Pg- IgY 能识别分子量为84、73、58、50、45、39、37、34 kD的条带(图4)，此蛋白可能是Pg的分解片段。

2.5 ELLSA测定IgY抗体滴度

蛋鸡经3次免疫后特异性抗体滴度高达25 600，并保持高滴度30 d，随后滴度迅速下降，待距第3次免疫70 d时抗体滴度下降到3 200，而空白对照组特异性抗体滴度始终接近0(图5)。以上结果显示，所得抗Pg- IgY能特异性结合Pg，说明本实验中使用的免疫程序和硫酸铵沉淀法纯化IgY都是可取的。

M.蛋白标记物;1.未纯化的水溶性IgY溶液;2.两步硫铵法纯化的IgY;3.ThermoIgY提纯试剂盒纯化的IgYM.蛋白标记物;1.未纯化的水溶性IgY溶液;2.一步硫铵法纯化的IgY;3.两步硫铵法纯化的IgYM.预染型marker;1.阴性对照组;2.Pg-IgY组

图2 IgY的非还原型SDS-PAGE分析图3 IgY的还原型SDS-PAGE分析图4 WesternBloting检测Pg-IgY抗体特异性

图5 抗Pg- IgY滴度变化曲线

2.6 抗Pg- IgY 抑制红细胞凝集实验

血球凝集(HA)试验结果显示，最低浓度为3×107CFU/mL 的Pg可引起红细胞凝集(箭头示)(图6a)。血球凝集抑制(HI)试验结果显示，每孔3.125 μgPg- IgY可有效抑制Pg的红细胞凝集活性(箭头示)，而非特异性的IgY无该功能(图6b)。红细胞凝集实验结果判定：红细胞沉于孔底呈点状为不凝集; 平铺呈网状为凝集。

图6 抗Pg- IgY抑制红细胞凝集实验(n为1×109 CFU/mL)

2.7 评价IgY对Pg生长的抑制作用

如图7所示，未免疫鸡的IgY组和1 mg/mLPg- IgY组的Pg在8 h后开始进入对数生长期，2、4 mg/mLPg- IgY组的Pg在10 h时开始进入对数生长期。结果显示，Pg- IgY可延迟Pg进入对数生长期的时间点，并能够抑制Pg生长，且具有浓度依赖性。统计学分析发现，1～5 h的每个时间点，4组间吸光度值两两相比均无统计学差异(P>0.05)；6～7 h时，未免疫鸡的IgY组与其他3个实验组相比均有统计学差异(P<0.05)，而3个实验组组间相比无统计学差异(P>0.05)；8～24 h 时，4组间两两相比均有统计学差异(P<0.05)。

图7 抗Pg- IgY对Pg生长作用影响

3 讨论

卵黄抗体(immunoglobulin Y，IgY)是禽类主要的血清免疫球蛋白，可经过血液由母体的特异性聚集于卵黄之中。Kovacs等研究发现在相同时间里，1只鸡所能提供IgY的量是1只兔子提供血清IgG的18倍，而且IgY的生产过程不需要采血，只需收集鸡蛋即可，不会对实验动物产生伤害[9]。Tini M等报道：每个卵黄含有50～100 mg IgY，其中2%～10%为特异性抗体，每只鸡1年大约可提供280只鸡蛋，因此使用少量的抗原免疫母鸡就可获得大量质量均一的特异性IgY[10]。

IgY是一种7S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同。该蛋白质分子量约为180 kD，含两个亚单位即65～70 kD的重链和22～30 kD的轻链。与哺乳类IgG相比，IgY的铰链区短、可变性差且Fc段长[11]。IgY具有以下特点：IgY不激活补体、不结合类风湿因子、不与哺乳动物Fc受体和补体结合、与哺乳动物免疫球蛋白之间不发生交叉血清学反应；理化稳定性好, 能耐酸, 耐热, 在温度低于75 ℃、pH>3的酸性环境中仍能很好地保持其生物学活性[12]。

近年来，IgY在疾病被动免疫治疗中得到广泛应用。C. Vega等[13]给感染了轮状病毒的小牛喂食抗轮状病毒的卵黄抗体，发现该卵黄抗体可治疗由轮状病毒引起的小牛腹泻。Smith DJ等用变异链球菌葡聚糖结合蛋白B (glucan- binding protein B,GBP- B)免疫鸡获得特异性抗GBP- B的IgY，发现该IgY可预防由变异链球菌引起的龋损[14], 含有抗变异链球菌葡糖基转移酶IgY的糖果能够抑制变异链球菌在健康青少年口内定植[15]。

卵黄抗体的提取方法有水稀释法、聚乙二醇沉淀法、硫酸葡聚糖沉淀法等。水稀释法获得抗体的产量和纯度最高，且应用的方便性和大规模生产的可能性也优于其他方法。本研究选用了改良水稀释法结合硫酸铵沉淀成功提取出抗Pg- IgY，平均每个鸡蛋可得到卵黄抗体70 mg，操作简便快捷，且抗体纯度较高。鸡卵黄中卵黄抗体的含量和鸡的品种、周龄及抗原的种类等因素有关。本研究采用罗曼母鸡，提取步骤是先得到卵黄抗体的水溶性成分，通过离心分离去除脂肪，再用硫酸铵沉淀两次得到卵黄抗体溶液，第1步硫酸铵沉淀后，纯度大约为50%，杂质主要是分子量为35 kD的载脂蛋白[16]、40 kD的卵黄高磷蛋白[17]。经过第2步硫酸铵沉淀杂带明显减少，纯度达到65%。

Pg是一种G-专性厌氧菌，是目前口腔内蛋白水解活性最强的细菌，因为它能产生半胱氨酸蛋白酶、胶原酶[18]。Hamajima S等用重组Pg外膜 40 kD蛋白免疫蛋鸡获得针对该蛋白的卵黄抗体，发现该卵黄抗体可有效抑制牙龈卟啉单胞菌与戈登链球菌的聚集[19]。Yokoyama K等使用牙龈素免疫白莱航鸡，获得抗牙龈素IgY，并且制成IgY浓度为20%的软膏，用于清洁刮治和根面平整后的牙周炎患者，结果发现，与未使用者相比，使用IgY软膏的患者Pg的数量少，临床症状轻[20]。这是利用牙周微生物进行被动免疫方面的重大尝试和进步。

由于Pg不能酵解糖，只能通过从局部环境中的氨基酸和多肽获取生长所需的营养物质，因此细菌在口腔上皮细胞和组织的黏附能力对于其生存至关重要，而Pg的红细胞凝集活性被认为与细菌黏附宿主细胞的能力相关，后者是细菌感染的第一步。铁/亚铁血红素是Pg生存和毒力发挥所必需的营养成分[21]，其来源主要为血红蛋白，因此Pg的红细胞凝集活性对其营养获取和生存亦至关重要[22]。单克隆抗体61BG1.3和mAb-Pg- vc可以抑制Pg的红细胞凝集活性，抗体识别和结合位点是由rgpA、kgp、hagA这3个基因编码的黏附片段Hgp44[23]。Simpson W等通过敲除A7436的kgp，成功构建了缺失kgp的Pg突变菌株，该突变菌株结合氯化血红素和血红蛋白的能力显著低于PgA7436，该突变菌株在含有血红蛋白的培养基中生长迟缓[24]。有研究发现，当rgpA rgpB基因突变体和rgpA kgp 基因突变体红细胞凝集活性降低时[25]，发现rgpA 、kgp 、hagA 基因突变体则无红细胞凝集活性[26]，表明这3个基因与Pg的红细胞凝集活性有关。本实验结果显示，特异性抗Pg- IgY能够抑制Pg的红细胞凝集活性，推测Pg- IgY能抑制Pg在牙周袋内的定植和增殖。有研究发现，抗Pg- IgY能识别Pg的诸多片段(84、73、58、50、45、39、37、34 kD), 而这些蛋白可能是Pg的分解片段[27]。Inoshita等已经从rgpA、kgp的黏附素区域纯化得到分子量分别为24、37、44 kD的片段[28]。卵黄抗体识别的50 kD条带被认为是rgpB分子[29]。

本研究成功制备了高效价特异性卵黄抗体，并通过两步硫铵沉淀纯化得到纯度较高的卵黄抗体，该抗体能识别牙龈卟啉单胞菌的诸多片段，抑制Pg生长，并且具有较好的中和Pg红细胞凝集活性。这为IgY的大规模制备提供了新的参考，也为IgY抗体应用于牙周病被动免疫治疗提供了实验依据。

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Preparation, purification and characterization of egg yolk immunoglobulin Y specific toporphyromonasgingivalis

DONG Yao*, XU Yan, MA Qian, MENG Ming- li, SHEN Ji- long, XU Zhen- shan, SONG Li- hua

(*StomatologicHospital﹠College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLab.ofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince,Hefei230032,China)

AIM: To prepare egg yolk immunoglobulin (IgY) againstPorphyromonasgingivalisand to study its biological characteristics. METHODS: Ten 150 day-old laying hens were immunized withPorphyromonasgingivalisand IgY was isolated from the egg yolk by the water dilution (WD) method and 2 steps of ammonium sulfate purification. The titers and specificity of the purified antibodies were assessed by ELLSA. The molecular weight were measured by SDS-PAGE. The antigenicity and function of the IgY were demonstrated by western blotting and the hemagglutination inhibition (HI) test respectively. RESULTS: The yield of IgY was 70 mg per yolk with the purity of 65%. Its titer was 25 600.Pg-IgY could bound specifically toPorphyromonasgingivalisand could inhibit the hemagglutination at 3.125 μg/well. CONCLUSION: The production and purity of IgY are high, the IgY has strong specificity against TPorphyromonasgingivalis.

porphyromonasgingivalis; immunoglobulin Y; egg yolk immunogolbuin

2015-01-08;

2015-06-09

安徽省自然科学基金 (1308085MH130，1408085MKL28)

董 瑶(1988-)，女，汉族，安徽宿州人。硕士生(导师：徐燕 )

徐 燕，E-mail：173236344@qq.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0459-06

安徽安科生物校企合作项目(K2015011)