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小分子靶向受体酪氨酸激酶抑制剂TW9183的合成及体外抗肿瘤活性

2015-11-19雷春花王雪玉杨育才吴振王立强

关键词:喹啉贴壁吉非

雷春花,王雪玉,杨育才,吴振,王立强

(1.华侨大学 生物医学学院,福建 泉州362021;2.台湾大学 生化科学系,台湾 台北106170;3.厦门大学 药学院,福建 厦门361101)

目前,酪氨酸激酶是国际上抗肿瘤药物研发的重要靶点[1].吉非替尼是一种苯胺喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂[2],于2003年获美国食品和药物管理局批准上市,作为非小细胞肺癌的靶向治疗药物.喹唑啉类化合物的构效关系表明,药效母核喹唑啉环上3-位的N 原子可被C 取代,形成具有较强药理活性的喹啉类化合物[3].研究表明,苯胺嘧啶类化合物也是一类重要的蛋白激酶抑制剂,对多种蛋白激酶有较好的抑制效果,许多已上市和临床阶段的药物中含有此结构单元[4].课题组以吉非替尼为先导,以喹啉环替代喹唑啉,在外侧苯环的4-位引入不同的苯胺嘧啶化合物,合成了一系列结构新颖的喹啉衍生物.经前期体外活性验证与计算机辅助的结构优化,筛选出候选药物TW9183,其化学名称为4-(7-氯喹啉-4-氨基)-N-{4-甲基-3-[4-(4-吡啶)嘧啶-2-氨基]苯基}苯甲酰胺,分子式为C32H24ClN7O.本文对TW9183的合成方法及其对3种人类肿瘤细胞株的体外抗肿瘤作用进行研究.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

人宫颈癌Hela、人非小细胞肺癌A549、人肝癌SMMC-7721、HUVEC 细胞株(上海中科院细胞库);MEM,F-12K 和RPMI-1640培养基(美国Invitrogen公司);四甲基偶氮唑盐(MTT,美国Sigma公司);胎牛血清(美国Hyclone公司);二甲基亚砜(DMSO,美国Amresco 公司);结晶紫、Hoechst 33342染色液、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒(上海市碧云天生物技术研究所);兔抗人Caspase-3抗体、兔抗人Actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(美国Abcam 公司);吉非替尼(辽宁省大连美仑生物技术有限公司);其他合成试剂(上海泰坦科技股份有限公司).

PB-10型pH 计、BS 224S型电子天平(德国Sartorius公司);Infinite M200型全功能酶标仪(西班牙Tecan Iberica公司);Eclipse TE2000-U 型荧光倒置显微镜(日本Nikon公司);ChemiDoc XRS型凝胶成像系统、Mini-PROTEAN Tetra C型垂直板电泳和转膜装置(美国Bio-Rad公司);FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD 公司);FRESCO 21型离心机(美国Thermo公司);WRR 型熔点仪(上海精密科学仪器有限公司);Vario EL Ⅲ型元素分析仪(德国Elementar公司);N-1001型旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会所);UNION 400型氢谱、碳谱(美国Varian公司);Esquire 3000plus型质谱仪(美国Bruker公司).

1.2 TW9183的合成

化合物TW9183的合成路线,如图1所示.

图1 TW9183的合成路线Fig.1 Synthesis route of TW9183

1.2.1 4-(7-氯喹啉-4-氨基)苯甲酸(Ⅰ)的合成 在100mL 的圆底烧瓶中加入4,7-二氯喹啉1.96g(10mmol)、对氨基苯甲酸1.36g(10mmol)和异丙醇(i-PrOH)20mL,搅拌使其充分溶解.缓慢升温至85 ℃,搅拌回流5h,薄层色谱(TLC)监测反应完全后,将反应液冷却至室温,减压蒸干,残留固体用30 mL二氯甲烷洗涤2次,抽滤得黄色固体中间体(I)4-(7-氯喹啉-4-氨基)苯甲酸2.68g,收率为90%.

1.2.2 4-(7-氯喹啉-4-氨基)苯甲酰氯(Ⅱ)的合成 在100mL 干燥的圆底烧瓶中加入含2.982g(10 mmol)中间体I的干燥二氯甲烷溶液15mL,搅拌,0 ℃冰浴下缓慢滴加氯化亚砜5.35g(45mmol),回流3h,减压蒸馏,得到淡黄色固体中间体(Ⅱ)4-(7-氯喹啉-4-氨基)苯甲酰氯2.71g,收率为95%.

1.2.3 TW9183的合成 在100mL干燥的圆底烧瓶中加入含中间体Ⅱ3.162g(10mmol)及2-(5-氨基-2-甲基苯胺)-4-(4-吡啶)嘧啶2.35g(8.5mmol)的四氢呋喃溶液40mL,搅拌.0 ℃冰浴下缓慢滴加三乙胺(Et3N)1.717g(17mmol),搅拌30min,45℃下反应7h.TLC检测反应完全后,抽滤,滤液减压蒸馏,固体用50mL 乙酸乙酯溶解,80mL 水萃取2次,合并有机相,无水硫酸钠干燥,减压蒸馏,用二氯甲烷/甲醇重结晶,得目标产物(TW9183)4.02g,收率为85%,熔点为292~296 ℃.

1.3 细胞培养

Hela,SMMC-7721,A549和HUVEC 细胞株分别接种于含体积分数为10%胎牛血清的MEM,RPMI-1640,F-12K 培养基中,置于37 ℃,体积分数为5% 的二氧化碳培养箱中培养,所有实验均采用对数生长期细胞.

1.4 MTT法测定细胞的增殖能力

将Hela,A549,SMMC-7721,HUVEC细胞以4×103个·孔-1接种于96孔培养板中.细胞完全贴壁后,分别给予不同浓度的TW9183(2,4,8,16μmol·L-1).阳性对照组给予相同浓度的吉非替尼,阴性对照组给予相同体积的DMSO,培养48h后加MTT 检测,计算半数抑制浓度(IC50)和相对细胞增殖率(RGR),实验重复3次.

1.5 平板克隆法测定细胞的克隆形成能力

将Hela,A549,SMMC-7721细胞以300个·孔-1接种于6孔板中.细胞完全贴壁后,药物处理同节1.4.48h后更换培养液,培养至培养板中出现肉眼可见的集落时终止,弃培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次,加入1mL质量分数为4%的多聚甲醛固定10min,弃多聚甲醛,PBS洗2~3次,加600 μL结晶紫染色液染色10min,流水洗去结晶紫,空气中干燥,计算克隆形成率,实验重复3次.

1.6 划痕法测定细胞的迁移能力

将Hela,A549,SMMC-7721细胞以1×105个·孔-1接种于24孔板中.细胞完全贴壁后,用200 μL移液枪枪头在单层细胞上呈"一"字划痕,弃培养液,PBS洗2次,药物处理同节1.4.48h后,置于倒置显微镜下观察并测量细胞发生迁移后的损伤距离,计算迁移率,实验重复3次.

1.7 Hoechst 33342法检测凋亡细胞形态

将Hela,A549,SMMC-7721细胞以4×103个·孔-1接种于96孔板中.细胞完全贴壁后,药物处理同节1.4.48h后吸弃培养液,每孔加入100μL质量分数为4%的多聚甲醛固定30min,吸弃多聚甲醛,PBS荡洗,每孔加入80μL Hoechst 33342染色10min,吸弃染色液,PBS荡洗,于荧光显微镜下观察,实验重复3次.

1.8 蛋白免疫印迹检测caspase-3蛋白的表达

将Hela,A549,SMMC-7721细胞以5×105个·孔-1接种于96孔板中.细胞完全贴壁后,分别给予不同浓度的TW9183(4,8,16μmol·L-1),阴性对照组给予同体积的DMSO.48h后吸弃培养基,PBS洗涤2次,每孔加入150μL Western及IP细胞裂解液,冰浴裂解30min,1 000r·min-1离心5min,收集上清液,凝胶电泳分离蛋白.将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上,质量分数为5%脱脂奶粉封闭后,一抗4 ℃封闭过夜,二抗室温封闭2h,ECL显色1~2min,荧光成像仪内曝光、检测,实验重复3次.

1.9 流式细胞术检测细胞周期分布

将Hela,A549,SMMC-7721细胞以2×105个·孔-1接种于6孔板中.细胞完全贴壁后,药物处理同节1.4.48h后消化并收集细胞,4℃固定过夜,加入0.5mL配制好的染色液(含PI,RNA 酶,染色缓冲液),缓慢并充分重悬细胞沉淀,于37 ℃避光温浴30min,用流式细胞仪检测,实验重复3次.

2 结果与讨论

2.1 TW9183的合成及结构鉴定

TW9183的详细合成路线,如图1所示.中间体I的结构经1H-NMR,13C-NMR 和ESI-MS表征确证,目标产物的结构经IR,1H-NMR,13C-NMR,ESI-MS和元素分析表征确证,具体结果如下所述.

4-(7-氯喹啉-4-氨基)苯甲酸(Ⅰ)为黄色固体粉末,收率为90%.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ值:8.61(d,J=9.29Hz,1H),8.47(d,J=7.03 Hz,1H),8.23~8.26(m,2H),8.00(d,J=2.01 Hz,1H),7.86(dd,J=9.29Hz,2.26Hz,1H),7.63(dd,J=6.78Hz,2.01Hz,2H),7.11(d,J=7.03Hz,1H).13C-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ值:168.41,150.39,149.52,148.36,147.21,136.12,132.15,130.21,126.83,123.29,21.38,18.26,115.17,112.85.ESI-MS,m/z为298.7[M-H]-.

4-(7-氯喹啉-4-氨基)苯甲酰氯(Ⅱ)为淡黄色固体粉末,收率为95%.

4-(7-氯喹啉-4-氨基)-N-{4-甲基-3-[4-(4-吡啶)嘧啶-2-氨基]苯基}苯甲酰胺(TW9183)为淡黄色的固体粉末,收率为85%,其熔点为292~296℃.IR(KBr),σ/cm-1:3 447,3 427,3 372,3 226,3 065,3 014,1 625,1 595,1 574,1 507,1 427,1 386,1 361,1 313,1 225,1 166,1 020,746.1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ值:2.25(s,3H),7.01(d,J=7.00Hz,1H),7.24(d,J=8.54Hz,1H),7.47(d,J=5.26Hz,1H),7.51(dd,J=8.04Hz,2.04 Hz,1H),7.64(d,J=7.76 Hz,1H),7.65(d,J=8.76 Hz,2H),7.93(dd,J=9.04Hz,2.00Hz,1H),8.12(d,J=2.24Hz,1H),8.14(d,J=2.04Hz,1H),8.18(d,J=8.54Hz,2H),8.55(d,J=5.26Hz,1H),8.62(dd,J=6.14Hz,2.00Hz,1H),8.63(d,J=6.8Hz,1H),8.76(d,J=4.76Hz,1H),8.79(d,J=9.04 Hz,1H),9.06(s,1H),9.34(s,1H),10.36(s,1H),11.14(s,1H).13C-NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ值:18.11,101.36,108.11,116.73,117.36,117.78,119.96,124.79,125.06,126.37,128.14,128.27,129.92,130.58,133.19,134.04,136.25,137.52,138.23,139.14,139.59,140.35,144.47,147.57,150.63,155.00,158.68,159.02,160.01,161.58,161.64,164.88.ESI-MS,m/z为558.2[M+H]+.Anal.(C32H24ClN7O):calcd C 68.87,H 4.30,Cl 6.37,N 17.58,O 2.87;found C 68.79,H 4.32,Cl 6.35,N 17.56,O 2.88.

2.2 TW9183对肿瘤细胞和HUVEC细胞增殖的影响

给药48h后,阴性对照组细胞均贴壁生长旺盛,细胞呈多角形,胞质饱满,相邻细胞生长融合成片,而给药组细胞随着给药浓度的增加细胞数明显减少,Hela细胞发生皱缩,逐渐漂浮起来,A549 和SMMC-7721细胞体积变大,扁平铺展.以细胞膨大为特征的细胞衰老是一种重要的抑瘤机制[4].因此,TW9183可能通过促进A549和SMMC-7721细胞的衰老达到抑制肿瘤的效果.TW9183对人肿瘤细胞的抗增殖作用,如表1所示.由表1可知:TW9183对Hela,A549和SMMC-7721 肿瘤细胞株表现出比吉非替尼更高的抑制力,表明TW9183可能具有潜在对宫颈癌、肺癌和肝癌的治疗作用.TW9183对HUVEC细胞相对增殖率的影响,如图2所示.由图2可知:TW9183作用后的HUVEC细胞相对增殖率较大,与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05),表明TW9183对正常HUVEC细胞在化合物作用范围内没有毒性.

表1 TW9183对人肿瘤细胞的 抗增殖作用(n=3)Tab.1 Anti-proliferation activity of TW9183on human tumor cells(n=3)

2.3 TW9183对肿瘤细胞克隆形成的影响

肿瘤细胞的克隆形成能力反映了细胞的群体依赖性和增殖能力,是肿瘤细胞成瘤的一个重要因素.TW9183作用于肿瘤细胞后,细胞的克隆形成能力不同程度地减弱,其中,TW9183降低Hela肿瘤细胞集落形成能力最为显著.对3种肿瘤细胞集落形成的统计值(η1),如图3所示.图3中:横坐标1~5分别代表0,2,4,8,16μmol·L-1的TW9183,6代表16μmol·L-1的吉非替尼;与阴性对照组相比,a代表P<0.05,b代表P<0.01;与相同浓度吉非替尼组(16.0μmol·L-1)相比,c代表P<0.01.由图3可知:TW9183抑制Hela,A549和SMMC-7721克隆形成的作用效果强于吉非替尼.

图2 TW9183对HUVEC细胞相对增殖率的影响Fig.2 Effects of TW9183on relative growth rate in HUVEC cell

图3 TW9183对Hela,A549和SMMC-7721细胞克隆形成的影响Fig.3 Effects of TW9183on colony formation in Hela,A549and SMMC-7721cells

2.4 TW9183对肿瘤细胞迁移的影响

肿瘤转移是肿瘤致死的主要原因[5-6],也是人们防治肿瘤时关注的重要因素.TW9183能不同程度地抑制Hela,A549和SMMC-7721细胞的迁移,其影响如图4所示.图4中:A,B,C,D,E 分别为0,2,4,8,16μmol·L-1的TW9183,F为16μmol·L-1的吉非替尼(×100).给药48h后,阴性对照组的划痕宽度不断缩小,而给药组随着给药浓度的增加,划痕愈合程度逐渐降低,细胞迁移率(η2)明显降低,与阴性对照组相比具有统计学意义(P<0.01),且高剂量组TW9183(16.0μmol·L-1)作用后的Hela细胞迁移率明显低于吉非替尼对照组(P<0.05),但对A549和SMMC-7721细胞的迁移抑制作用与吉非替尼组无统计学意义.TW9183对Hela,A549和SMMC-7721细胞迁移率的影响,如图5所示.图5中:1~5分别代表浓度为0,2,4,8,16μmol·L-1的TW9183,6代表浓度为16μmol·L-1的吉非替尼;与阴性对照组相比,b代表P<0.01;与相同浓度吉非替尼(16.0μmol·L-1)组相比,c代表P<0.05.

2.5 TW9183对肿瘤细胞凋亡的影响

图4 TW9183对Hela,A549和SMMC-7721细胞迁移的影响Fig.4 Effects of TW9183on migration in Hela,A549,and SMMC-7721cells

图5 TW9183对Hela,A549和SMMC-7721细胞迁移率的影响Fig.5 Effects of TW9183on migration rate in Hela,A549,and SMMC-7721cells

TW9183作用于3种肿瘤细胞后,细胞数明显减少,荧光强度增加,而阴性对照组细胞的细胞核形态规则,荧光较弱,且着色均匀.不同浓度的TW9183和吉非替尼可使部分细胞出现致密浓染或碎块状致密浓染,表明药物作用后细胞凋亡增加.其中,Hela细胞凋亡效果较明显,其结果如图6所示.图6中:A~E分别为0,2,4,8,16μmol·L-1的TW9183,F为16μmol·L-1的吉非替尼(×100).

2.6 TW9183对肿瘤细胞caspase-3蛋白表达的影响

细胞凋亡有多种因素参与,其中,caspase-3蛋白酶在凋亡信号传导中起核心作用[7].它在细胞内以无活性的前体(酶原)形式存在,激活后导致凋亡的发生.TW9183对Hela,A549和SMMC-7721细胞caspase-3蛋白表达的影响,如图7所示.由图7可知:不同浓度的TW9183作用3种肿瘤细胞48h后,随TW9183浓度的增大,caspase-3蛋白相对分子量32kD 的酶原表达量逐渐减少,17kD 的活性成分表达量逐渐增加,提示TW9183作用于肿瘤细胞后可激活caspase-3,发挥促进肿瘤细胞凋亡的效应.

图6 TW9183对Hela细胞 凋亡的影响Fig.6 Effects of TW9183on nuclear apoptosis in Hela cells

图7 TW9183对Hela、A549和SMMC-7721细胞caspase-3蛋白表达的影响Fig.7 Effects of TW9183on expression of caspase-3 protein in Hela,A549and SMMC-7721cells

2.7 TW9183对肿瘤细胞周期分布的影响

与阴性对照组相比,各浓度TW9183作用后,肿瘤细胞的G2/M 期细胞比率均有不同程度的增加,且该结果呈现剂量依赖性,表明TW9183主要诱导肿瘤细胞阻滞于G2/M 期;而吉非替尼主要将细胞周期阻滞于G0/G1 期,二者阻滞的细胞周期不同,有待进一步研究.

3 结论

文中合成的目标化合物是一种新的喹啉衍生物.红外光谱、碳谱、氢谱、电喷雾质谱及元素分析结果证实该化合物与所设计的TW9183结构相符,其收率达到85%.此法操作简便,原料便宜易得,反应效率高,易于进行工业化生产.

细胞异常增殖、迁移以及细胞去分化都是肿瘤形成的重要原因[8].通过MTT、平板克隆、划痕实验等证实,TW9183对Hela,A549和SMMC-7721细胞的增殖、迁移均有一定的抑制作用.Hoechst 33342染色、Western blot和流式细胞术还表明:TW9183不同程度地促进这3种细胞的凋亡,将细胞周期阻滞在G2/M 期.所有实验均证实TW9183较吉非替尼表现出更强的体外抗肿瘤活性,但其抗肿瘤作用机制及体内动物实验还需后续继续研究.

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