杨继敏++朱科学

摘 要 对电热鼓风干燥和真空冷冻干燥的胡椒梗主要组分进行分析，并采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法（SPME-GC-MS）对两种干燥方式下胡椒梗中的香气成分进行研究。结果发现，胡椒梗中胡椒碱含量0.07～0.10 g/hg、脂肪含量约0.9%、粗蛋白含量17%～19%、总酚含量2.5%～2.8%、维生素C含量2.8～5.6 mg/hg。胡椒梗中鉴定出的主要化学成分为：芳樟醇、δ-榄香烯、古巴烯、石竹烯、律草烯、杜松烯含量较多，以石竹烯含量最高（≥52.55%）。

关键词 胡椒梗 ；胡椒碱 ；香气成分 ；GC-MS

分类号 TS207.3

胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科胡椒属多年生常绿藤本植物，原产于印度，是世界上重要的热带香辛料作物，是人们非常喜爱的调味品，在医学工业和食品工业都有广泛用途[1]。胡椒果实主要化学成分包括：生物碱（主要是吡咯烷类酰胺生物碱）、挥发油、有机酸、木脂素、酚类化合物、脂肪、蛋白质、淀粉和微量元素等[2]。

胡椒粒中胡椒精油含量约1%～2%，主要成分是萜烯类物质，包括单萜类化合物、单萜类氧化物和倍半萜类化合物，是胡椒的主要风味物质，具有暖身、活血、刺激血液循环的功效；其中胡椒碱含量8%～9%，是胡椒的主要辛辣成分，具有抗氧化作用、抗菌等多种生理药理活性；胡椒油树脂包含胡椒总的辛辣刺激与芳香成分，具有比较广泛的药理作用，可作为加工保健及功能（效）食品的原料[3]。胡椒的经济价值非常高，胡椒果实中含有酰胺类杀虫活性物质等有效成分，可用来加工成黑胡椒、白胡椒等初产品；胡椒穗等部位中胡椒碱含量较高，能够用于开发胡椒碱产品开发利用；同时，胡椒提取物有自由基清除能力以及抗食用油脂氧化作用，可用于治疗胃寒呕吐、食欲不振及预防胆囊结石等病症；胡椒根乙醇提取物具有显著的镇痛、抗炎、镇静以及抗惊厥效果；胡椒粒在穴位贴敷治疗肩周炎方面具有良好的效果[4]。

目前对于胡椒果、胡椒叶的研究颇多，国内外关于胡椒果实、茎、叶、根挥发油研究已有报道。而胡椒脱粒后的胡椒梗大多被废弃，鲜有研究报道。因此，本研究以胡椒梗作为原料，经过电热鼓风干燥箱和真空冷冻干燥机两种干燥方式后，对其胡椒碱含量及香气成分进行检测分析，研究结果可为胡椒全植株的利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

胡椒鲜果由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供，将胡椒粒去除后保留胡椒梗并进行清洗，然后分别放在电热鼓风干燥箱中（45±2）℃干燥24 h和真空冷冻干燥按照研究室青胡椒真空冷冻干燥工艺进行[5]，粉碎后过80目筛，备用。

1.1.2 试剂

95%乙醇（分析纯）：西陇化工股份有限公司；胡椒碱标准品：北京世纪奥科生物技术有限公司；石油醚（沸程30～60℃，分析纯）：西陇化工股份有限公司；没食子酸： 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗坏血酸：广东光华化学厂有限公司；碳酸钠：广东·汕头市西陇化工厂；福林酚：上海荔达生物科技有限公司；磷酸二氢钾（≥99.5%）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 设备

AL104 电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；QE-300G高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；FD-2真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；MB45快速水分测定仪（美国奥豪斯仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）；Z36HK 离心机（德国Hermle）；Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）； SDXTEC2050脂肪测定系统（丹麦福斯FOSS公司）；NDA701杜马斯定氮仪（意大利VELP公司）；7890A/5975C GC/MS 联用仪（美国安捷伦公司）；SPME手动进样手柄（美国安捷伦公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头（美国安捷伦公司）。

1.2 方法

1.2.1 胡椒碱含量的测定

将两种不同干燥方式处理的胡椒梗样品粉碎过筛，根据GB/T17528-2009《胡椒碱含量的测定 高效液相色谱法》规定的方法测定。即准确称取0.2 g胡椒梗粉末样品，精确至0.000 1，用95%乙醇回流提取3 h，提取液经过滤并定容至100 mL棕色容量瓶中。取1 mL滤液稀释至25 mL容量瓶中并用95%乙醇定容，所有过程均避光处理。平行3次。稀释液过0.45 μm膜后用HPLC测定，外标法定量。

色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：77%甲醇和23%水；流速：1.0 mL/min；色谱柱温度：30℃；检测波长：343 nm；进样量：10 μL。

1.2.2 脂肪含量的测定

首先将铝制称量皿放入电热鼓风干燥箱中，在（103±2）℃温度下干燥至恒重（前后称量差不超过0.002 g）。然后将过筛样品，准确称取2 g左右，精确至0.000 1，放入滤纸筒内，往脂肪测定仪器中注入沸程（30～60）℃石油醚，仪器自动提取完毕后，取出铝制称量皿，置于（103±2）℃干燥箱内干燥1 h，取出并放入干燥器内冷却至室温，称量后再放入干燥箱内0.5 h，取出冷却，称量，重复操作直至前后2次称量差不超过0.002 g。平行测定3次，取均值。

1.2.3 粗蛋白含量测定——杜马斯燃烧法

测定步骤： 称取50～100 mg样品于锡箔纸中压实，挤出空气，并置于自动落样器上，待上机检测。

样品燃烧反应条件： 温度为1 200 ℃，氧气因子为1.8 mL/mg，氧气流速为400 mL/min，氦气、氧气、氮气压力分别为2.0、2.5和3.0 Pa，高温下充分燃烧分解，生成的气体被净化、除杂，以氦气为载气传送，氮氧化物被还原后，混合气体被吸附，分离，依次通过检测器（TCD）检测定量[6]。样品粗蛋白含量计算公式： 粗蛋白含量=总氮含量/样品质量×换算系数6.25。每组做3次平行，取平均值。

1.2.4 总酚含量的测定

采用福林酚法[7]测总酚含量，取1 g胡椒梗粉末样品，加入30 mL质量分数60%乙醇在40 ℃下震荡（100 r/min）提取4 h，5 000×g离心20 min。取0.1 mL上清液加入4.9 mL稀释10倍的福林酚试剂和3 mL质量分数为10%的Na2CO3，40℃下反应60 min后，在750 nm处测量吸光值。每组样品做3个平行求平均值，根据以没食子酸作的标准曲线计算总酚的质量分数，样品中总酚的质量分数用没食子酸当量（mg/g）表示。

1.2.5 Vc含量的测定

参照Tiwari[8]的方法，采用HPLC测定维生素C含量，并略作修改。样品前处理：取约2 g胡椒梗粉末样品，加入30 mL 2.5%偏磷酸溶液，4 ℃下静置提取3 h，在12 000 r/min、4 ℃下离心10 min，过滤得维生素C提取液，取上清液用0.45 μm的滤膜过滤。

HPLC测定：流动相A为乙腈，流动相B为25 mmol/L的磷酸二氢钾溶液（磷酸调pH值为3.0）；检测波长为254 nm；洗脱条件 95%的KH2PO4和5%乙腈等度洗脱；温度30℃；进样量10 μL；流速1 mL/min。

1.2.6 固相微萃取法（SPME）提取胡椒的香气物质[9]

将固相微萃取的萃取纤维头在气相色谱的进样口老化，老化温度为250℃，载气体积流量为0.8 mL/min，分流比为50∶1，老化时间为0.5 h。称取适量胡椒梗粉，置于15 mL 密封顶空样品瓶中，用固相微萃取纤维头50/30 μm DVB/CAR/PDMS 于45℃顶空萃取30 min，然后在250℃条件下解吸8 min 进样。

GC-MS分析[10]，色谱条件：色谱柱，DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度为45℃，以10℃/min升至85℃；以5℃/min升至160℃并保持2 min；再以15℃/min升至220℃；载气：氦气；柱流量1.00 mL/min；分流比10∶1。质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量， 70 eV；离子源温度230℃；接触面温度为250℃；ACQ方式：Scan；扫描范围，40～400 amu；扫描速度：769/s。

1.2.7 数据分析

实验数据用Excel、Origin、SAS软件及仪器自带软件处理，差异显著性水平<0.05，平均数之间的比较采用极差检验。

2 结果与分析

2.1 两种干燥方式下胡椒梗中胡椒碱及其他成分含量

胡椒碱液相色谱及标准曲线见图1。

由图1可知，胡椒碱的出峰时间基本在5.35 min处，而标准曲线R2=0.999 9。此标准曲线的相关性较好，可用于计算胡椒梗中胡椒碱的含量。

Vc分析见图2。由图2可知，Vc的出峰时间基本在5.4 min左右，所得标准曲线R2=0.999 5，此标准曲线的相关性较好，可用于计算胡椒梗中Vc的含量。

胡椒梗中胡椒碱及其他成分含量见表1。

胡椒碱是胡椒主要的活性物质，也是胡椒的主要辛辣成分，由表1可知，胡椒梗中胡椒碱的含量很低，远少于胡椒种子中胡椒碱（8%～9%）含量。胡椒梗中的脂肪含量非常低，远少于胡椒种子中含有6%～8%的粗脂肪。杜马斯燃烧法测粗蛋白，结果准确、重现性好，其前处理简单，时间短，成本低，且避免造成环境污染，适用于油料实际样品粗蛋白含量检测[6]，结果显示，胡椒梗中粗蛋白含量高于17%。福林酚试剂测量总酚法是研究天然产物抗氧化活性的常用方法，它方便、简单并且重现性好等优点[11]，本实验福林酚法结果表明胡椒梗中的总酚含量约为2%～3%。维生素C是维持人体正常生理代谢的一种重要化合物，可参与体内氧化还原反应，具有解毒的作用，人体自身不能合成，必须由食物中获得，而从表1可以知，胡椒梗中的Vc含量为2.8～5.6 mg/hg。

此外，通过统计分析，发现冷冻和热风干燥两种方式胡椒梗中胡椒碱、脂肪的含量没有差异，说明两种干燥方式对胡椒碱、脂肪几乎没有影响。然而，两种干燥方式下胡椒梗中粗蛋白、总酚、Vc含量具有显著性差异，说明不同的干燥方式对于胡椒梗中的粗蛋白、总酚、Vc含量有一定影响。真空冷冻干燥对胡椒梗Vc含量基本没有影响，而热风干燥由于温度较高使其分解流失，损失较严重。

2.2 两种干燥方式下胡椒梗GC-MS结果分析

热风干燥和冷冻干燥胡椒梗GC-MS图谱见图3、4。

采用固相微萃取法检测胡椒梗中的香气成分，采用背景扣除、自动积分和面积归一化法计算各组分相对含量。对各峰质谱图进行NIST谱库检索和人工谱图解析，通过GC-MS数据库搜索和结合文献、MS和部分保留指数，鉴定化学物质如表2所示。

由表2可知，热风干燥胡椒梗鉴定出25种化学成分，冷冻干燥胡椒梗中分离鉴定出29种化学成分，且面积百分比之和均在99%以上。其中共有成分中芳樟醇、δ-榄香烯、古巴烯、石竹烯、律草烯、杜松烯含量较多，以石竹烯含量最高。这些大量的共同成分使两种干燥方式的胡椒梗具有相似的气味，而且这些含量较多的物质中有很多具有生物活性。如δ-榄香烯具有显著的抗肿瘤作用；而β-榄香烯属国家二类非细胞毒性肿瘤药物，药理研究表明，石竹烯具有局麻、抗炎等作用[11]。从两种干燥方式胡椒梗中不同的化学成分发现，冷冻干燥胡椒梗中的单萜类物质较多，而倍半萜类物质较电热鼓风干燥胡椒梗中的含量稍低，可能是由于热风干燥时温度相对较高，对单萜类化学物质产生的影响。

3 讨论

目前，风味成分分析方法有很多种，如溶剂萃取、蒸馏萃取和固相微萃取等，其中最常用也最有效的胡椒有效成分的分析方法是气相色谱-质谱联用技术。国内对黑、白胡椒以及胡椒精油的化学成分分析较多，如柳中等[12]分析了海南黑、白胡椒的香气成分，得出主体香气成分为α-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、β-月桂烯、D-柠檬烯和石竹烯等物质；谭乐和等[13]对胡椒挥发油的研究表明，胡椒精油的主要成分为3-蒈烯、柠檬烯、反式-石竹烯、β-蒎烯、L-水芹烯、α-蒎烯等；郭墨亭等[14]通过超声波处理提取胡椒幼果、黑胡椒和白胡椒的胡椒油树脂，并采用GC-MS测定比较其香气成分，最终从胡椒幼果油树脂中分离出25种物质，鉴定出20种；黑、白胡椒油树脂中均分离出28种物质，鉴定出23种；胡椒油树脂香味成分主要是α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、D-柠檬油精、4-乙烯基-4-甲基-3-（1-甲基乙烯基）环己烯、石竹烯和胡椒碱等。以上研究的胡椒中香气成分与本文所鉴定出的香气物质成分有所差异。然而，在国外Kapoor等[15]人得到黑胡椒精油的主要成分为石竹烯、柠檬烯、蒎烯和香荟烯；Singh等[16]鉴定出黑胡椒挥发油的主要成分为石竹烯、柠檬烯、香荟烯、β-红没药烯和α-古巴烯；Jirovetz等[17]运用固相微萃取-气相色谱分析和固相微萃取-气相色谱-质谱分析，对比干燥胡椒芳香成分和喀麦隆的几内亚黑、白胡椒的香精油成分，发现含量较高的物质为β-石竹烯、D-吉玛烯、柠檬烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-蛇麻烯等；与本文鉴定出的主要香气成分较接近。

通过研究发现，胡椒梗中胡椒碱含量为0.07～0.10 g/hg，脂肪含量约0.9%，粗蛋白含量17%～19%，总酚含量2.5%～2.8%，维生素C含量2.8～5.6 mg/hg。而从胡椒梗中鉴定出的主要成分为：芳樟醇、δ-榄香烯、古巴烯、石竹烯、律草烯、杜松烯含量较多，以石竹烯含量最高（≥52.55%）。

本论文对电热鼓风干燥和真空冷冻干燥胡椒梗中的胡椒碱、脂肪、粗蛋白、总酚及Vc含量进行分析检测，并运用固相微萃取法对两种干燥方式的胡椒梗进行香气成分及含量分析。此外，还分析了电热鼓风干燥和真空冷冻干燥对胡椒梗以上各物质含量的影响，为胡椒全果植株的利用提供了基础。

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